Bij faagdisplaytechnologie wordt een vreemd doelgen in een specifieke positie in het capside-eiwit van de faag ingebracht, waardoor het vreemde gen op het oppervlak van de faag tot expressie komt zonder de normale functie van de faag te beïnvloeden. Na verschillende screeningsrondes werd uiteindelijk een doeleiwit met een hoge specificiteit en biologische activiteit verkregen.

Met deze technologie kunnen antilichaambibliotheken met een hoge capaciteit worden gegenereerd. De screeningscyclus is kort, het operationele proces is eenvoudig en het toepassingsgebied is breed, waardoor optimale sequenties voor gerichte peptiden of eiwitten kunnen worden geïdentificeerd. In virusgerelateerde toepassingen kunnen onderzoekers antilichamen ontdekken die binden aan cruciale virale epitopen door grote antilichaambibliotheken te screenen. Dit proces kan de toegang, replicatie of immuunontwijkingsmechanismen van virussen belemmeren, en zo een basis leggen voor de behandeling van ziekten.

Fagedisplaytechnologie wordt veel vaker gebruikt dan hybridomatechnologie, die beperkt is tot het produceren van een kleine hoeveelheid antilichamen tegen specifieke immunogenen. Fagedisplaytechnologie daarentegen kan een complete antilichaambibliotheek presenteren, afkomstig van verschillende immuunsoorten.

Faagdisplaytechnologie kent een breed scala aan toepassingen, waaronder het screenen van receptoren van pathogene micro-organismen, het bestuderen van eiwitinteracties, het volgen van signaaloverdracht tussen cellen, het diagnosticeren van dierziekten en het ontwikkelen van vaccins, naast vele andere gebieden.

Fagedisplaytechnologie biedt talrijke voordelen en kan op diverse gebieden worden toegepast. De grootste uitdaging bij de ontwikkeling van recombinante antilichamen met behulp van de fagedisplaymethode is echter de complexiteit en de kosten van het proces. Deze aanpak vereist de integratie van moleculair-biologische technieken, waaronder mutatie, klonering en expressie, samen met immunologische, biochemische en biofysische analyses om de gewenste antilichamen te identificeren en te karakteriseren.

Antigeenpresentatie is een zeer belangrijke schakel. De methoden voor antigeenpresentatie omvatten hoofdzakelijk directe gecoate antigeenpresentatie, indirecte gecoate antigeenpresentatie, antigeenpresentatie via screening van hele cellen, antigeenpresentatie via liposomen, nanofosfolipideschijven en VLP's.

De directe coatingmethode is relatief eenvoudig, maar de antigeenconformatie kan gemakkelijk veranderen. De indirecte coatingmethode is complexer, maar kan de antigeenconformatie behouden en de presentatie-efficiëntie verbeteren. Celscreening kan de werkelijke situatie in vivo simuleren, maar er is een probleem met niet-specifieke binding. Nanofosfolipideschijven hebben een klein formaat, een hoge afleveringsefficiëntie en een goede stabiliteit. VLP's zijn gefuseerd met antigeen of omhuld met antigeen, wat resulteert in een hoge immunogeniteit en goede veiligheid, en kan een sterke immuunrespons opwekken.

Als de concentratie te laag is, neemt de kans op binding met de faag af, wat resulteert in een lagere screeningsefficiëntie. Omgekeerd kan een te hoge concentratie de kans op niet-specifieke binding vergroten, het achtergrondsignaal verhogen en de identificatie van positieve klonen bemoeilijken.

Er kan een milde fixatiemethode worden toegepast om hoge temperaturen, sterke zuren en basen te vermijden. De indirecte coatingmethode en het biotine-streptavidinesysteem werden gebruikt om schade aan de antigeenstructuur te beperken. Als het antigeen een membraaneiwit is, kan het op het oppervlak van intacte cellen worden weergegeven of kan een membraanomgeving, zoals een nanodisk, worden gebruikt om de natuurlijke membraaneiwitconformatie te behouden.

Naast routinematige experimenten zoals ELISA, Western Blotting (WB) en immunofluorescentie (IF), kunnen detectietechnieken zoals Surface Plasmon Resonance (SPR) en Bio-Layer Interferometry (BLI) worden gebruikt om de bindings- en dissociatieprocessen van antilichamen en antigenen in realtime te volgen, waardoor de affiniteit en kinetische parameters kunnen worden bepaald.

Fagedisplay kan worden gebruikt om monoklonale antilichamen met een hoge affiniteit te genereren voor een breed scala aan antilichaamproducerende soorten, waaronder, maar niet beperkt tot, mensen, muizen, ratten, konijnen, kippen, kamelen, alpaca's, koeien, honden, schapen, apen en haaien.

De constructietechnologie van muizenantilichaambibliotheken is goed ingeburgerd, kosteneffectief en kent een korte experimentele duur, waardoor deze geschikt is voor voorlopige antilichaamscreening en fundamenteel onderzoek. Konijnenantilichamen vertonen een sterke affiniteit en specificiteit, met een breder epitopenherkenningsbereik in vergelijking met muizenantilichamen. Menselijke antilichamen kunnen rechtstreeks worden verkregen uit menselijke antilichaambibliotheken, waardoor potentiële immuunreacties die kunnen optreden bij toediening van heterologe antilichamen aan het menselijk lichaam worden vermeden. Deze aanpak is van grote waarde voor geneesmiddelenonderzoek en -ontwikkeling, met name voor de ontwikkeling van therapeutische antilichamen.

Dierlijke immunogenen worden over het algemeen onderverdeeld in eiwitantigenen, polypeptide-antigenen, nucleïnezuurantigenen en pathogeen-gerelateerde antigenen. Tot de pathogeen-gerelateerde antigenen behoren virusantigenen (compleet virusdeeltje, virusproteïne, niet-structureel virusproteïne, enz.), bacteriële antigenen (compleet bacterie-extract, celwandcomponent, afgescheiden proteïne, toxine, enz.) en parasietantigenen.

De immunogenen kunnen worden aangepast door immuunantigenen te vervangen door recombinante eiwitten en door de virusdeeltjes die de brand bestrijden te vervangen door de structurele eiwitten van virussen. Het experimentele ontwerp kan worden aangepast en de immuundosering kan worden gewijzigd.

De immunogeniteit kan worden versterkt door antigenen te koppelen aan dragereiwitten, zoals runderserumalbumine. Daarnaast kunnen immuunadjuvantia, waaronder Freund's adjuvans en aluminiumadjuvans, worden gebruikt om de verblijftijd in vivo te verlengen en de activering en proliferatie van immuuncellen te stimuleren, waardoor de immunogeniteit wordt verbeterd.

Een faag-antilichaambibliotheek is een verzameling van diverse faag-antilichamen die worden gecreëerd door een complete set variabele regio-genen van antilichamen in faagvectoren te assembleren en deze tot expressie te brengen op het oppervlak van fagen. Dit proces resulteert in de vorming van een faag-antilichaambibliotheek.

Het algemene proces van faagdisplay omvat verschillende belangrijke stappen: het extraheren van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) van geïmmuniseerde dieren, het isoleren van totaal RNA en het transcriberen ervan naar complementair DNA (cDNA), het vermenigvuldigen van het doelgen met behulp van polymerasekettingreactie (PCR), het kloneren van het doelgen in een faagvector en het transformeren van de vector in een gastcel voor expressie. Dit proces resulteert in de constructie van een faagdisplaybibliotheek, waarmee snel antilichamen met een hoge affiniteit kunnen worden geïdentificeerd. Deze bibliotheek kan vervolgens dienen als een waardevolle bron voor de ontwikkeling van vaccins, therapeutische geneesmiddelen en diagnostische reagentia.

Afhankelijk van de bron van de antilichaambibliotheek kunnen faag-antilichaambibliotheken worden onderverdeeld in immuunfaag-antilichaambibliotheken en natieve faag-antilichaambibliotheken. Het belangrijkste verschil tussen deze twee typen is of de dieren zijn gevaccineerd. Daarnaast kunnen natieve antilichaambibliotheken worden gegenereerd door middel van semisynthese of synthese.

Er zijn twee belangrijke indicatoren voor het beoordelen van de kwaliteit van een antilichaambibliotheek: opslagcapaciteit en diversiteit. Een grote opslagcapaciteit, gecombineerd met een hoge diversiteit, zorgt voor een effectieve screening van antilichamen met zowel een hoge affiniteit als specificiteit.

Bij biologische elutriatie wordt de displaybibliotheek geïncubeerd met gefixeerde targets en vervolgens grondig gewassen om niet-reactieve fagen te verwijderen. Conjugaten worden doorgaans geëlueerd met een zure of zoutrijke oplossing en vervolgens vermenigvuldigd in geschikte gastheercellen voor verrijking. Na 3 tot 5 screeningsrondes worden antilichamen met een hoge affiniteit verkregen.

Fagenscreeningmethoden omvatten hoofdzakelijk solid-phase panning, liquid-phase screening en celgebaseerde screening. Bij de keuze van een geschikte screeningmethode moet rekening worden gehouden met de kenmerken van de doelmoleculen, de doelstellingen van het screeningproces en de laboratoriumomgeving.

Positieve screening is de meest fundamentele methode voor het screenen van faagantilichamen die binden aan doelwitproteïnen. Negatieve screening dient om niet-specifieke antilichamen te elimineren. Tijdens het screeningsproces van faagantilichamen kunnen niet-specifieke antilichamen worden geïdentificeerd als gevolg van interferentie van het label van het doelwitantigeen, materialen of andere antigenen met structurele overeenkomsten met het doelwitantigeen. In dergelijke gevallen kan negatieve screening de efficiëntie van het screeningsproces verhogen.

De methoden voor antilichaamverificatie omvatten doorgaans ELISA, Western Blotting (WB), flowcytometrie, immunoprecipitatie (IP), immunofluorescentie (IF), immunohistochemie en diverse andere experimentele technieken. Alpha Lifetech heeft uitgebreide ervaring met antilichaamdetectie en beschikt over een professioneel experimenteel team, wat de effectiviteit van antilichamen in daaropvolgende experimenten garandeert.