Faagdisplaytechnologie bestaat uit het inbrengen van het vreemde doelgen op de specifieke positie van het faagcapside-eiwit en het tot expressie brengen van het vreemde gen op het oppervlak van de faag zonder de normale functie van de faag te beïnvloeden. Na verschillende screeningsrondes werd uiteindelijk het doeleiwit met een sterke specificiteit en hoge biologische activiteit verkregen.

Met deze technologie kunnen antilichaambibliotheken met een hoge capaciteit worden gegenereerd. De screeningcyclus is kort, het operationele proces is eenvoudig en de toepassingsmogelijkheden zijn uitgebreid, wat de identificatie van optimale sequenties voor beoogde peptiden of eiwitten mogelijk maakt. In virusgerelateerde toepassingen kunnen onderzoekers antilichamen ontdekken die zich binden aan kritieke virale epitopen door grote antilichaambibliotheken te screenen. Dit proces kan de toegang, replicatie of immuunontwijkingsmechanismen van virussen belemmeren en zo een basis leggen voor ziektebehandeling.

Faagdisplaytechnologie wordt breder toegepast dan hybridomatechnologie, die beperkt is tot de productie van een kleine hoeveelheid antilichamen tegen specifieke immunogenen. Faagdisplaytechnologie daarentegen kan een volledige antilichaambibliotheek presenteren, afkomstig van verschillende immuunsoorten.

De fagendisplaytechnologie kent een breed scala aan toepassingen, waaronder het screenen van receptoren van pathogene micro-organismen, het bestuderen van eiwitinteracties, het volgen van signaaloverdracht tussen cellen, het diagnosticeren van dierziekten en het ontwikkelen van vaccins.

Faagdisplaytechnologie biedt talloze voordelen en kan in diverse vakgebieden worden toegepast. De grootste uitdaging bij de ontwikkeling van recombinante antilichamen met behulp van de faagdisplaymethode is echter de complexiteit en de kosten die met het proces gepaard gaan. Deze aanpak vereist de integratie van moleculair-biologische technieken, waaronder mutatie, klonering en expressie, in combinatie met immunologische, biochemische en biofysische analyses om de gewenste antilichamen te identificeren en te karakteriseren.

Antigeenpresentatie is een zeer belangrijke schakel. De methoden voor antigeenpresentatie omvatten voornamelijk directe gecoate antigeenpresentatie, indirecte gecoate antigeenpresentatie, antigeenpresentatie via volledige celscreening, antigeenpresentatie via liposomen, nanofosfolipideschijven en VLP's.

De directe coatingmethode is relatief eenvoudig, maar de antigeenconformatie is gemakkelijk te veranderen. De indirecte coatingmethode is complex, maar kan de antigeenconformatie behouden en de presentatie-efficiëntie verbeteren. Celscreening kan de werkelijke situatie in vivo simuleren, maar er is een probleem met niet-specifieke binding. Nanofosfolipideschijven zijn klein, hebben een hoge afgifte-efficiëntie en een goede stabiliteit; VLP's zijn gefuseerd met antigeen of omwikkeld met antigeen, wat een hoge immunogeniciteit en goede veiligheid biedt en een sterke immuunrespons kan opwekken.

Een te lage concentratie vermindert de kans op binding met de fage, wat resulteert in een verminderde screeningsefficiëntie. Omgekeerd kan een te hoge concentratie de kans op niet-specifieke binding vergroten, het achtergrondsignaal versterken en de identificatie van positieve klonen belemmeren.

Een milde fixatiemethode kan worden gebruikt om hoge temperaturen, sterke zuren en basen te vermijden. De indirecte coatingmethode en het biotine-streptavidinesysteem werden gebruikt om de schade aan de antigeenstructuur te beperken. Als het antigeen een membraaneiwit is, kan het worden weergegeven op het oppervlak van intacte cellen of worden gebruikt om de membraanomgeving te simuleren, bijvoorbeeld met een nanoschijf, om de natuurlijke conformatie van het membraaneiwit te behouden.

Naast routinematige experimenten zoals ELISA, Western Blotting (WB) en immunofluorescentie (IF), kunnen Surface Plasmon Resonance (SPR) en Bio-Layer Interferometry (BLI) detectietechnieken worden gebruikt om de bindings- en dissociatieprocessen van antilichamen en antigenen in realtime te bewaken, waardoor affiniteits- en kinetische parameters kunnen worden bepaald.

Faagdisplay kan worden gebruikt om monoklonale antilichamen met een hoge affiniteit te genereren voor een breed scala aan antilichaamproducerende soorten, waaronder (maar niet beperkt tot) mensen, muizen, ratten, konijnen, kippen, kamelen, alpaca's, koeien, honden, schapen, apen en haaien.

De constructietechnologie van muizenantilichaambibliotheken is goed ingeburgerd, kosteneffectief en heeft een korte experimentele duur, waardoor ze geschikt zijn voor voorlopige antilichaamscreening en fundamenteel onderzoek. Konijnenantilichamen vertonen een sterke affiniteit en specificiteit, met een breder epitoopherkenningsbereik in vergelijking met muizenantilichamen. Menselijke antilichamen kunnen rechtstreeks uit menselijke antilichaambibliotheken worden verkregen, waardoor mogelijke immuunreacties die kunnen optreden bij toediening van heterologe antilichamen aan het menselijk lichaam, worden vermeden. Deze aanpak is van grote waarde in geneesmiddelenonderzoek en -ontwikkeling, met name bij de ontwikkeling van therapeutische antilichamen.

Dierlijke immunogenen worden over het algemeen onderverdeeld in proteïne-antigeen, polypeptide-antigeen, nucleïnezuur-antigeen en pathogeen-gerelateerd antigeen. Tot de pathogeen-gerelateerd antigeen behoren het virusantigeen (het complete virusdeeltje, het viruseiwit, het niet-structurele viruseiwit, enz.), het bacterieel antigeen (het complete bacterie-extract, de celwandcomponent, het uitgescheiden eiwit, de toxine, enz.) en het parasietenantigeen.

Pas immunogenen aan door immuunantigenen te vervangen door recombinante eiwitten en door deeltjes van brandbestrijdingsvirussen te vervangen door de structurele eiwitten van virussen. Pas het experimentele ontwerp aan en wijzig de immuundosering.

Immunogeniciteit kan worden verbeterd door antigenen te koppelen aan dragereiwitten, zoals runderserumalbumine. Daarnaast kunnen immuunadjuvantia, waaronder Freund's adjuvans en aluminiumadjuvans, worden gebruikt om de verblijftijd in vivo te verlengen en de activering en proliferatie van immuuncellen te stimuleren, waardoor de immunogeniciteit wordt verbeterd.

Een faag-antilichaambibliotheek is een verzameling van diverse faag-antilichamen, gecreëerd door een complete set variabele regiogenen uit antilichamen te assembleren in faagvectoren en deze tot expressie te brengen op het oppervlak van fagen. Dit proces resulteert in de vorming van een faag-antilichaambibliotheek.

Het algemene proces van faagdisplay omvat verschillende belangrijke stappen: het extraheren van mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMC) uit geïmmuniseerde dieren, het isoleren van totaal RNA en het transcriberen ervan naar complementair DNA (cDNA), het amplificeren van het doelgen met behulp van polymerasekettingreactie (PCR), het klonen van het doelgen in een faagvector en het transformeren van de vector naar een gastheercel voor expressie. Dit proces resulteert in de constructie van een faagdisplaybibliotheek, die snel antilichamen met hoge affiniteit kan identificeren. Deze bibliotheek kan vervolgens dienen als waardevolle bron voor de ontwikkeling van vaccins, therapeutische geneesmiddelen en diagnostische reagentia.

Afhankelijk van de bron van de antilichaambibliotheek kunnen faag-antilichaambibliotheken worden onderverdeeld in immuunfaag-antilichaambibliotheken en natieve faag-antilichaambibliotheken. Het belangrijkste onderscheid tussen deze twee typen ligt in de vraag of de dieren gevaccineerd zijn. Daarnaast kunnen natieve antilichaambibliotheken worden gegenereerd via semi-synthese of synthese.

Er zijn twee primaire indicatoren voor het evalueren van de kwaliteit van een antilichaambibliotheek: opslagcapaciteit en diversiteit. Een grote opslagcapaciteit, gecombineerd met een hoge diversiteit, zorgt voor effectieve screening van antilichamen met zowel hoge affiniteit als specificiteit.

Tijdens biologische elutriatie wordt de displaybibliotheek geïncubeerd met gefixeerde targets en vervolgens uitgebreid gewassen om niet-reactieve fagen te verwijderen. Conjugaten worden doorgaans geëlueerd met een zure of zoutrijke oplossing en vervolgens geamplificeerd in geschikte gastheercellen voor verrijking. Na 3 tot 5 screeningsrondes worden antilichamen met een hoge affiniteit verkregen.

Faagscreeningsmethoden omvatten voornamelijk vastefase-panning, vloeistoffase-screening en celgebaseerde screening. Bij de keuze van een geschikte screeningsmethode moet rekening worden gehouden met de kenmerken van de doelmoleculen, de doelstellingen van het screeningsproces en de laboratoriumomgeving.

Positieve screening is de meest fundamentele methode voor het screenen van faagantilichamen die zich binden aan doeleiwitten. Negatieve screening dient om niet-specifieke antilichamen te elimineren. Tijdens het screeningsproces van faagantilichamen kunnen niet-specifieke antilichamen worden geïdentificeerd als gevolg van interferentie van het doelantigeenlabel, materialen of andere antigenen met structurele overeenkomsten met het doelantigeen. In dergelijke gevallen kan negatieve screening de efficiëntie van het screeningsproces verbeteren.

Methoden voor antilichaamverificatie omvatten doorgaans ELISA, Western Blotting (WB), flowcytometrie, immunoprecipitatie (IP), immunofluorescentie (IF), immunohistochemie en diverse andere experimentele technieken. Alpha Lifetech beschikt over uitgebreide ervaring in antilichaamdetectie en een professioneel experimenteel team, dat de effectiviteit van antilichamen in vervolgexperimenten waarborgt.