Ontwikkelingsplatform voor de humanisering van antilichamen

Gehumaniseerde antilichamen roepen minimale of geen reactie op bij het menselijk immuunsysteem. Volgens Cognitive Market Research bedraagt de wereldwijde markt voor antilichaamhumanisatie USD 92,5 miljoen in 2024 en zal deze groeien met een samengesteld jaarlijks groeipercentage (CAGR) van 13,00% van 2024 tot 2031. Alpha Lifetech beschikt over een volwaardig platform voor antilichaamhumanisatie, met een succespercentage van meer dan 98% voor gehumaniseerde antilichamen. We bieden diverse humanisatiestrategieën, waaronder CDR-grafting, SDR-grafting, ketenherschikking, faagdisplay, enz., die kunnen worden geselecteerd op basis van uw experimentele behoeften. We kunnen niet alleen antilichamen van verschillende diersoorten humaniseren, zoals muizen, konijnen, alpaca's, kamelen, enz., maar ook antilichamen in verschillende vormen, zoals scFv, Fab en nanobodies. Wij beschikken over professioneel technisch personeel voor de productie, zuivering en validatie van antilichamen, waaronder de productie van monoklonale muizenantilichamen, chimere antilichamen, expressie en zuivering van gehumaniseerde antilichamen, en karakterisering en analyse van gehumaniseerde antilichamen. Met een hoog slagingspercentage, hoge zuiverheid en lage immunogeniteit garanderen wij de productie van gehumaniseerde antilichamen.

Inleiding tot antilichaamhumanisatie

Therapie met monoklonale antilichamen kan worden gebruikt voor de behandeling van auto-immuunziekten, kanker en andere aandoeningen. Monoklonale antilichamen worden geproduceerd door muizen of andere dieren te immuniseren. Bij de behandeling van ziekten in een later stadium van de productie van monoklonale antilichamen mag de immunogeniteit van niet-menselijke antilichamen niet worden genegeerd. Het belangrijkste principe van humanisering is het integreren van niet-menselijke raamwerkresiduen, zoals hypervariabele complementaire-determinantregio's (CDR's), in het menselijke raamwerk, waardoor sequenties ontstaan die de oorspronkelijke antilichaamkenmerken behouden en tegelijkertijd immunogeniteit voorkomen. Immunisatie van muizen en de daaropvolgende humanisering van de muizensequentie blijven twee van de belangrijkste methoden voor het ontdekken van therapeutische antilichamen, die hoofdzakelijk verschillende stadia doorlopen: productie van muizenantilichamen, chimerisatie van monoklonale antilichamen, chimere muizen-menselijke monoklonale antilichamen en de ontwikkeling van volledig gehumaniseerde monoklonale antilichamen. Momenteel omvat het onderzoek voornamelijk transgene muizen (het overbrengen van menselijke B-celgenen naar muizen), high-throughput screening met behulp van gist- of faagdisplaytechnologie, CDR-grafting (het invoegen van ouderlijke CDR's in menselijke sequenties), transplantatiespecifieke bepaling van residuen (SDR), framework shuffling en andere methoden.

Figuur 1: Schematisch overzicht van de humanisering van antilichamen, van muizenantilichamen (groene domeinen) tot volledig menselijke antilichamen.

Antilichaamhumaniseringsstrategie

CDR-transplantatie

CDR-transplantatie wordt bereikt via een zoogdier-expressiesysteem gebaseerd op recombinant-DNA-technologie, en de belangrijkste stappen zijn:

(1) Ontwikkel overeenkomstige antilichamen in muizen (of niet-menselijke bronnen), isoleer DNA dat codeert voor de antilichamen en kloon ze in vectoren voor sequentiebepaling (of voer rechtstreeks single-cell sequentiebepaling uit).

(2) Om de DNA-sequentie te bepalen die overeenkomt met de CDR van het antilichaam en om de doelbindingsspecificiteit te bepalen;

(3) Selecteer het menselijke frameworkgebied (FR) om niet-menselijke CDR's te transplanteren en een nieuw antilichaamgen te construeren.

(4) Voer een driedimensionale analyse uit van conflicten tussen niet-menselijke CDR's en menselijke FR's om herstelmutaties te genereren die de lus stabiliseren en verlies van affiniteit of structurele integriteit van het uiteindelijke gehumaniseerde antilichaam voorkomen.

Figuur 2: Schematisch overzicht van het enten van de complementariteitsbepalende regio (CDR).

Framework-herschikking

Framework shuffling maakt gebruik van faagdisplaytechnologie en faagbibliotheekscreeningtechnologie om antilichamen met een hoge affiniteit te verkrijgen. Oligonucleotiden die coderen voor de frameworks van de zware ketens van menselijke antilichamen worden gebruikt als templates, CDR-regio's worden gecodeerd als primers en PCR-amplificatie wordt uitgevoerd om het PCR-product te denatureren en enkelstrengs DNA te verkrijgen. Enkelstrengs DNA van de VL- en VH-genen, gezuiverd met streptavidine, wordt gereconstrueerd op vectoren met behulp van T4 DNA-ligase en restrictie-enzymen, geïncubeerd met bacteriofagen en geamplificeerd door bacteriofagen, waarna een faagdisplaybibliotheek wordt geconstrueerd. Drie screeningsrondes met overeenkomstige antigenen worden uitgevoerd en positieve klonen worden uiteindelijk geverifieerd met behulp van ELISA en andere methoden.

Figuur 3: Schematische illustratie van de humaniseringsstrategieën voor het enten van de complementariteitsbepalende regio (CDR) en het herschikken van het framework (FR). (A) De belangrijkste procedure van het enten van de CDR. (B) Het belangrijkste proces van het herschikken van het FR. (Bron: Wang Yongmei et al., Vergelijking van “framework shuffling” en “CDR grafting” bij de humanisering van een PD-1 muizenantilichaam.)

Fage-display

De productie van gehumaniseerde antilichamen is gebaseerd op de methode waarbij specifieke antilichamen op het oppervlak van bacteriofagen worden weergegeven. Deze bacteriofagen worden voornamelijk geconstrueerd met behulp van faagbibliotheken met menselijke antilichamen. De bron van de bibliotheek zijn PBMCs (perifeer bloed van mensen) die worden geïsoleerd om faagbibliotheken samen te stellen, waaruit overeenkomstige sequenties worden gescreend. Deze sequenties bevatten de volledige menselijke sequentie, maar de geproduceerde antilichamen zijn antilichaamfragmenten, zoals scFv, Fab en nanobody.

Werkstroom voor de humaniseringsservice van antilichamen

Servicestappen	QC-standaard	Tijdlijn
Antilichaamisolatie	Zuiverheid >95%	1-2 weken
Sequentieanalyse	Nauwkeurige identificatie van niet-menselijke sequenties	1 week
CDR-transplantatie en raamwerktransplantatie	Succesvolle integratie en expressie	2-3 weken
Expressie en zuivering	Hoge opbrengst en zuiverheid	2-3 weken
Functionele validatie	Beoordeling van affiniteit en specificiteit	1 week

Voordelen van het antilichaamhumaniseringsplatform

Alpha Lifetech beschikt over een volwaardig platform voor de humanisering van antilichamen, met een succespercentage van meer dan 98% voor gehumaniseerde antilichamen.