Aptamerkarakteriseringsanalyseservice

Alpha Lifetech levert al jarenlang aptamerengerelateerde diensten en kan momenteel uitgebreide aptamerenontwikkelingstrajecten aanbieden, zoals aptamerensynthese, SELEX-screening, high-throughput sequencing en aptamerenoptimalisatie en -karakterisering. Gebaseerd op de voordelen van de SELEX-methode voor het screenen van aptameren, heeft Alpha Lifetech meer methoden voor het screenen van aptameren ontwikkeld.

Inleiding tot aptamerkarakteriseringsanalyse

Affiniteitsverificatie

De geoptimaliseerde aptameeraffiniteit werd geverifieerd met behulp van relevante technieken van de aptameerbindingsassay. Voorbeelden hiervan zijn isotherme titratiecalorimetrie (ITC), flowcytometrie (FCM), oppervlakteplasmaresonantie (SPR), microfluïdica, enz. Aptameeraffiniteit wordt meestal uitgedrukt in de dissociatieconstante (KD), een fysische grootheid die wordt gebruikt om de mate van moleculaire dissociatie in een reversibele reactie te kwantificeren. Hoe lager de KD-waarde, hoe stabieler het complex, dat wil zeggen, hoe sterker de affiniteit; omgekeerd, hoe hoger de KD-waarde, hoe instabieler het complex en hoe zwakker de affiniteit. Deze stap is essentieel voor het identificeren van de prestaties van het aptameer, het garanderen van de affiniteitsrijping van het aptameer en het binden aan het doelmolecuul met hoge affiniteit en selectiviteit in praktische toepassingen.

Figuur 1. Proces van aptameeraffiniteitsrijping. Referentiebron:Kinghorn AB, Fraser LA, 2017.

Functieverificatie

Naast affiniteitsverificatie moet ook de functie van het aptameer worden geverifieerd. Dit omvat het verifiëren van de stabiliteit, specificiteit en interacties van het aptameer met andere moleculen in een specifieke omgeving. De resultaten van functionele verificatie hebben een directe invloed op de waarde van aptameren in wetenschappelijk onderzoek en industriële toepassingen.

Specifieke verificatie

Competitief experiment: Het vermogen van de aptameer om zich aan een specifiek doelwit te binden, wordt geëvalueerd in aanwezigheid van andere, vergelijkbare doelwitten. Als de aptameer zich specifiek aan het doelwitmolecuul kan binden zonder interferentie van andere moleculen, duidt dit op een hoge specificiteit.

Kruisreactie-experiment: De aptameer wordt gebonden aan een reeks verwante of niet-verwante targets om te zien of het alleen aan één specifiek target bindt, om zo de specificiteit ervan te verifiëren.

Stabiliteitsverificatie

Experiment met nuclease-afbraak: De aptameren werden blootgesteld aan verschillende concentraties nucleasen en hun afbraak werd geobserveerd. Door de mate van afbraak op verschillende tijdstippen te vergelijken, kan het anti-nuclease-afbraakvermogen van het aptameer worden geëvalueerd.

Experiment met temperatuur- en tijdstabiliteit: Het aptameer werd onder verschillende temperatuur- en tijdsomstandigheden geplaatst om de structurele en functionele stabiliteit ervan te observeren. Dit helpt bij het bepalen van de optimale bewaar- en gebruiksomstandigheden voor aptameren.

Identificatie van biologische activiteit

De geschikte methode wordt gewoonlijk gekozen op basis van het specifieke toepassingsdoel van het nucleïnezuuraptameer.

(1)Testen op moleculair niveau: Met behulp van moleculair-biologische technieken, zoals gelelektroforese, Western blot, enz., worden de complexen gedetecteerd die worden gevormd nadat de aptameer zich verbindt met het doelmolecuul, of worden de veranderingen in het expressieniveau van het doelmolecuul gedetecteerd die worden veroorzaakt door de aptameer.

(2) Testen op celniveau: met behulp van celkweektechnologie worden aptameren geïncubeerd met doelcellen om biologische veranderingen zoals celmorfologie, proliferatie en apoptose te observeren en de biologische activiteit van aptameren te evalueren.

(3) Testen met diermodellen: In geschikte diermodellen worden nucleïnezuuraptameren toegediend via injectie of toediening van geneesmiddelen, en worden fysiologische indicatoren en pathologische veranderingen bij dieren waargenomen om de biologische activiteit en veiligheid van de aptameren in vivo te evalueren.