Aptamer Research Service
Afhankelijk van de verschillende analysebehoeften van klanten, biedt Alpha Lifetech een verscheidenheid aan aptameranalysestrategieën waaruit klanten kunnen kiezen.
NEEM CONTACT MET ONS OP01
Aptamer Research Service
Inleiding tot aptameren
Aptameren zijn enkelstrengs nucleïnezuurmoleculen (zoals DNA of RNA) die in vitro worden geselecteerd uit een bibliotheek van synthetische oligonucleotiden met willekeurig toegewezen sequenties via een proces genaamd SELEX-screening, dat meerdere rondes van iteratieve selectie omvat. De belangrijkste onderdelen van de aptamerontwikkelingsdiensten van Alpha Lifetech omvatten de constructie van aptamerbibliotheken, aptamer-SELEX-screening, aptamer-SELEX-sequencing, aptamersequentieanalyse en andere aptameranalyses.
SELEX-sequencing combineert aptamer-SELEX-screening met high-throughput-sequencing. Door middel van aptamer-SELEX-sequencing kan de specifieke sequentie van het aan het doelwit gebonden aptamer efficiënt worden bepaald, wat basisgegevens oplevert voor daaropvolgende aptamersequentieanalyse en -toepassing.
Aptameren worden veelvuldig gebruikt in wetenschappelijk onderzoek, ziektebehandeling, de ontwikkeling van biosensoren, geneesmiddelenonderzoek en milieumonitoring. De in vitro gescreende oligonucleotide-aptameren worden echter gemakkelijk afgebroken in vivo en kunnen zelfs toxisch zijn. Daarom is na optimalisatie van de gescreende aptameren een in vitro-analyse nodig om het succes van de aptamerontwikkeling te evalueren. Alpha Lifetech biedt klanten diverse aptameranalysestrategieën aan, afhankelijk van hun specifieke analysebehoeften.
Figuur 1. Diagram van aptameeranalyse. Referentiebron:Thevendran R, Citartan M. 2022. Tests om de bindingsaffiniteit van aptameren te schatten..
Inleiding tot de Aptamer Research Service
Aptamerstabiliteitsanalyse
Nuclease-afbraak experiment
Door het aptameer onder specifieke omstandigheden te incuberen met verschillende soorten nucleasen (zoals DNase, RNase, enz.), wordt de afbraak van het aptameer waargenomen, waardoor het vermogen tot afbraakbestendigheid kan worden geëvalueerd. Dit is nuttig om de stabiliteit en duurzaamheid van het aptameer in praktische toepassingen te bepalen.
Fluorescentielabelingsmethode
De stabiliteit van het aptameer wordt indirect geëvalueerd door de fluoroforen op het aptameer te labelen en de veranderingen in het fluorescentiesignaal te observeren vóór en na binding met het doelwit. Wanneer een aptameer bijvoorbeeld aan een doelwit bindt, kan de conformatie ervan veranderen, wat resulteert in een versterkt of verzwakt fluorescentiesignaal.
Thermische stabiliteitsanalyse
De thermische stabiliteit van het aptameer wordt beoordeeld door de verandering van het smeltpunt (Tm-waarde) bij verschillende temperaturen te meten. Hoe hoger het smeltpunt van het aptameer, hoe beter de thermische stabiliteit.
Dynamische stabiliteitsanalyse
Oppervlakteplasmonresonantie (SPR) en andere technologieën werden gebruikt om het bindings- en ontkoppelingsproces tussen het aptameer en het doelwit in realtime te volgen, dynamische parameters te verkrijgen (zoals de bindingssnelheidsconstante, de dissociatiesnelheidsconstante, enz.), het interactiemechanisme tussen het aptameer en het doelwit beter te begrijpen en de dynamische stabiliteit ervan te evalueren.
Structurele stabiliteitsanalyse
Röntgenkristallografie, kernmagnetische resonantie (NMR) en andere structurele biologietechnieken werden gebruikt om de driedimensionale structuur van het aptameer en de structurele stabiliteit ervan te analyseren.
Aptameerspecifieke analyse
Aptameer-bindingsassay
De affiniteit wordt bepaald door middel van een aptameerbindingsassay, waarbij de bindingsconstante tussen het aptameer en het doelmolecuul wordt gemeten, zoals de dissociatieconstante Kd. Een lagere Kd-waarde duidt op een hogere affiniteit. Met een aptameerbindingsassay kunnen kandidaat-geneesmiddelen met een hoog bindingsvermogen worden geselecteerd, waarna vervolgens farmacodynamische en farmacokinetische studies kunnen worden uitgevoerd.
Omgekeerd screeningexperiment
Een reverse screening-assay is een screeningmethode om snel niet-doelmoleculen uit een groot aantal kandidaatmoleculen te verwijderen. Reverse screening is ontworpen om moleculen uit te sluiten die deze eigenschap of functie niet bezitten. De sleutel tot een succesvolle reverse screening ligt in het selecteren van geschikte markers of omstandigheden die het mogelijk maken om niet-doelmoleculen tijdens het screeningproces te identificeren en te verwijderen. In dit experiment is de selectie van niet-doelmoleculen van groot belang. Er moet voor gezorgd worden dat de geselecteerde niet-doelmoleculen representatief zijn voor stoffen die de aptamerscreening kunnen verstoren en dat mogelijke storende factoren zo volledig mogelijk worden afgedekt.
Competitief remmingsexperiment
Door een overmaat aan concurrenten (zoals moleculen met een vergelijkbare structuur als het doelmolecuul) toe te voegen aan het bindingssysteem van het aptameer en het doelmolecuul, wordt de verandering in het bindingsvermogen van het aptameer en het doelmolecuul waargenomen. Als het vermogen van het aptameer om aan het doelmolecuul te binden significant afneemt, duidt dit erop dat het aptameer een hoge specificiteit heeft.
In sommige gevallen kunnen competitieve inhibitie-experimenten worden gebruikt als onderdeel van of als aanvulling op reverse screening-experimenten. Bijvoorbeeld, in het screeningsproces van geneesmiddelen kan het vermogen van het geneesmiddelmolecuul om zich aan het doelwitproteïne te binden worden geëvalueerd door middel van competitieve inhibitie-experimenten, waarna reverse screening-experimenten kunnen worden gebruikt om die verbindingen te verwijderen die te sterk gebonden zijn aan normale cellen of weefsels.
Aptameer cytotoxiciteitsanalyse
Er bestaan diverse experimentele methoden voor de analyse van aptameercytotoxiciteit, die zijn ontworpen om de effecten van aptameren op celoverleving, -proliferatie of -functie te evalueren.
| Methoden | Gedetailleerde introductie | Voordeel | Nadeel |
|---|---|---|---|
| MTT-detectiemethode | De MTT-test is een methode gebaseerd op de enzymactiviteit in de mitochondriën van levende cellen. Het succinaatdehydrogenase in de mitochondriën van levende cellen kan exogeen MTT reduceren tot het wateronoplosbare blauwpaarse formazankristal en dit in de cel afzetten, terwijl dode cellen deze functie niet hebben. Door deze kristallen op te lossen met dimethylsulfoxide (DMSO) en de absorptie bij specifieke golflengten (zoals 490 nm of 570 nm) te meten met een enzymometer, kan indirect het aantal levende cellen worden bepaald en zo de cytotoxiciteit van het aptameer worden beoordeeld. | Hoge gevoeligheid, zuinigheid en gebruiksgemak | Zware werkdruk, organische oplosmiddelen kunnen cellen beschadigen; alleen de uiteindelijke experimentele resultaten kunnen worden verkregen en het volledige proces van cytotoxiciteit kan niet worden waargenomen. |
| CCK-8-detectiemethode | Cell Counting Kit-8 (CCK-8) is een zeer gevoelige, niet-radioactieve colorimetrische detectiemethode. CCK-8 bevat WST-8, dat door dehydrogenase in de mitochondriën van levende cellen wordt gereduceerd tot de zeer wateroplosbare oranje mezan-kleurstof. De hoeveelheid geproduceerde mezan-kleurstof is lineair gerelateerd aan het aantal levende cellen. Het aantal levende cellen kan indirect worden bepaald door de lichtabsorptiewaarde van de mezan-kleurstof bij een golflengte van 450 nm te meten, waarmee de cytotoxiciteit van het aptameer kan worden geëvalueerd. | Eenvoudige bediening, geen celreiniging nodig, snelle detectie, breed lineair detectiebereik, hoge gevoeligheid, goede herhaalbaarheid, geringe cytotoxiciteit. | Hoge reagentiaprijzen; het is soms moeilijk vast te stellen of de verminderde absorptie te wijten is aan een afname van het aantal levende cellen of aan een afname van de activiteit van het celdehydrogenase zelf. |
| LDH-detectiemethode | LDH (lactaatdehydrogenase) is een enzym dat stabiel is in het cytoplasma van cellen. Wanneer het celmembraan beschadigd raakt, komt LDH vrij buiten de cel. LDH kan melkzuur katalyseren tot pyruvaat en reageren met INT (tetrazoliumzouten) om een paarse kristallijne stof te vormen. Door de absorptie ervan bij een specifieke golflengte (zoals 490 nm) te meten, kan de mate van celbeschadiging worden bepaald en kan de cytotoxiciteit van het aptameer worden geëvalueerd. | Het geeft een direct beeld van de celdood, veroorzaakt minder schade aan de cellen en er is geen sprake van besmetting met radioactieve isotopen. | De noodzaak om de cellen regelmatig uit de incubator te halen, maakt de procedure ingewikkelder; alleen de uiteindelijke experimentele resultaten kunnen worden verkregen en het volledige cytotoxiciteitsproces kan niet worden waargenomen. |
| Realtime live celbeeldanalyse | Met behulp van een realtime live-celbeeldanalysator werd het instrument in de incubator geplaatst om het volledige proces van de celgroeicyclus in realtime te observeren en vast te leggen. De cytotoxiciteit van aptameren kan worden geëvalueerd door de morfologische veranderingen en groeicurven van cellen te analyseren. Deze methode levert zowel video- als kwantitatieve resultaten van cytotoxische processen op, terwijl de celgroeiomgeving stabiel blijft. | Het systeem kan het cytotoxische proces in realtime volgen, maakt niet-destructieve beeldvorming mogelijk en vermindert interferentie en schade aan cellen. Zowel video- als kwantitatieve resultaten zijn beschikbaar voor diepgaande analyse. | De apparatuur is duur en vereist professionele bedieningsvaardigheden en analytisch vermogen. |
KACHI
Voordelen van de Aptamer Research Service
Totale kwaliteitscontrole
Geoptimaliseerde aptameren met hogere stabiliteit
Voordelig en efficiënt. Een scherpere prijs, betere service.
Uitgebreide onderzoekslocaties en diverse onderzoeksmethoden
Professioneel advies voorafgaand aan de verkoop en ondersteuning na de verkoop.
Ruime ervaring in aptameranalyse
Hoogwaardig R&D-team
Diensten op maat met betrekking tot aptameren
Heeft u vragen? Neem dan gerust contact met ons op.
Leave Your Message
0102