Aptamer Onderzoeksdienst
Op basis van de verschillende analysebehoeften van klanten biedt Alpha Lifetech een verscheidenheid aan aptameranalysestrategieën waaruit klanten kunnen kiezen.
NEEM CONTACT MET ONS OP01
Aptamer Onderzoeksdienst
Inleiding tot Aptamer
Aptameren zijn enkelstrengs nucleïnezuurmoleculen (zoals DNA of RNA) die in vitro worden gescreend uit een bibliotheek van synthetische oligonucleotiden met willekeurig toegewezen sequenties via een proces genaamd SELEX-screening, dat bestaat uit meerdere rondes van iteratieve selectie. De belangrijkste onderdelen van de aptamerontwikkelingsdiensten van Alpha Lifetech zijn onder meer de constructie van aptamerbibliotheken, APtamer SELEX-screening, APtamer SELEX-sequencing, APtamersequentieanalyse en andere aptameranalyses.
SELEX-sequencing combineert aptamer-SELEX-screening met high-throughput-sequencing. Met behulp van aptamer-SELEX-sequencing kan de specifieke sequentie van het aan het doelwit gebonden aptamer efficiënt worden bepaald, wat basisgegevens oplevert voor latere analyse en toepassing van de aptamersequentie.
Aptameren worden veelvuldig gebruikt in wetenschappelijk onderzoek, ziektebehandeling, biosensorconstructie, medicijnontwikkeling en milieumonitoring. De in vitro gescreende oligonucleotide-aptameren bleken echter gemakkelijk in vivo af te breken en vertoonden zelfs toxiciteit. Daarom is na optimalisatie van de gescreende aptameren in vitro analyse vereist om het succes van de aptamerenontwikkeling te evalueren. Afhankelijk van de verschillende analysebehoeften van klanten biedt Alpha Lifetech een verscheidenheid aan aptameranalysestrategieën waaruit klanten kunnen kiezen.
Figuur 1 Diagram van aptameeranalyse. Referentiebron:Thevendran R, Citartan M. 2022. Tests om de bindingsaffiniteit van aptameren te schatten.
Inleiding tot Aptamer Research Service
Aptameer stabiliteitsanalyse
Experiment met nuclease-afbraak
Door de aptameer onder specifieke omstandigheden te incuberen met verschillende soorten nucleasen (zoals DNase, RNase, enz.), wordt de afbraak van de aptameer geobserveerd en kan het anti-afbraakvermogen ervan worden geëvalueerd. Dit is nuttig om de stabiliteit en duurzaamheid van de aptameer in praktische toepassingen te bepalen.
Fluorescerende labelmethode
De stabiliteit van het aptameer wordt indirect geëvalueerd door de fluoroforen op het aptameer te labelen en de veranderingen in het fluorescentiesignaal te observeren vóór en na binding aan het target. Wanneer een aptameer bijvoorbeeld aan een target bindt, kan de conformatie veranderen, wat resulteert in een versterkt of verzwakt fluorescentiesignaal.
Thermische stabiliteitsanalyse
De thermische stabiliteit van het aptameer wordt beoordeeld door de verandering van de smelttemperatuur (Tm-waarde) bij verschillende temperaturen te meten. Hoe hoger de smelttemperatuur van het aptameer, hoe beter de thermische stabiliteit.
Dynamische stabiliteitsanalyse
Oppervlakte-plasmonresonantie (SPR) en andere technologieën werden gebruikt om het bindings- en ontkoppelingsproces tussen de aptameer en het doelwit in realtime te bewaken, dynamische parameters te verkrijgen (zoals bindingssnelheidsconstante, dissociatiesnelheidsconstante, enz.), het interactiemechanisme tussen de aptameer en het doelwit beter te begrijpen en de dynamische stabiliteit ervan te evalueren.
Structurele stabiliteitsanalyse
Röntgenkristallografie, kernmagnetische resonantie (NMR) en andere structurele biologische technieken werden gebruikt om de driedimensionale structuur van het aptameer en de structurele stabiliteit ervan te analyseren.
Aptameer-specifieke analyse
Aptamer-bindingstest
Affiniteit wordt beoordeeld met behulp van een aptameerbindingstest om de bindingsconstante tussen het aptameer en het doelmolecuul te meten, zoals de dissociatieconstante Kd. Een lagere Kd-waarde duidt op een hogere affiniteit. Een aptameerbindingstest kan kandidaat-geneesmiddelen met een hoog bindingsvermogen selecteren en vervolgens farmacodynamiek- en farmacokinetische studies uitvoeren.
Omgekeerd screening-experiment
Een reverse screening assay is een screeningmethode om snel niet-doelmoleculen uit een groot aantal kandidaatmoleculen uit te sluiten. Reverse screening is ontworpen om moleculen uit te sluiten die deze eigenschap of functie niet bezitten. De sleutel tot reverse screening is het selecteren van geschikte reverse screening-markers of -omstandigheden die het mogelijk maken om niet-doelmoleculen te identificeren en te verwijderen tijdens het screeningsproces. In dit experiment is de selectie van niet-doelmoleculen zeer belangrijk. Er moet voor worden gezorgd dat de geselecteerde niet-doelmoleculen representatief zijn voor stoffen die de aptameerscreening kunnen verstoren en dat mogelijke verstorende factoren zo volledig mogelijk worden afgedekt.
Competitief inhibitie-experiment
Door overmatige concurrenten (zoals moleculen met een vergelijkbare structuur als het doelmolecuul) toe te voegen aan het bindingssysteem van de aptameer en het doelmolecuul, wordt een verandering in het bindingsvermogen van de aptameer en het doelmolecuul waargenomen. Als het vermogen van de aptameer om het doelmolecuul te binden significant afneemt, wijst dit erop dat de aptameer een hoge specificiteit heeft.
In sommige gevallen kunnen experimenten met competitieve inhibitie worden gebruikt als onderdeel van of als aanvulling op reverse screening-experimenten. Zo kan bijvoorbeeld bij medicijnscreening het vermogen van het medicijnmolecuul om zich aan het doeleiwit te binden worden geëvalueerd door middel van experimenten met competitieve inhibitie, waarna reverse screening-experimenten kunnen worden gebruikt om de verbindingen te verwijderen die te sterk aan normale cellen of weefsels gebonden zijn.
Aptamer cytotoxiciteitsanalyse
Er bestaan diverse experimentele methoden voor de analyse van de cytotoxiciteit van aptameren. Deze methoden zijn ontworpen om de effecten van aptameren op het overleven, de proliferatie of de functie van cellen te evalueren.
| Methoden | Gedetailleerde introductie | Voordeel | Nadeel |
|---|---|---|---|
| MTT-detectiemethode | MTT-test is een methode gebaseerd op enzymactiviteit in de mitochondriën van levende cellen. De succinaatdehydrogenase in de mitochondriën van levende cellen kan exogeen MTT reduceren tot het in water onoplosbare blauwpaarse kristal formazan en dit in de cel afzetten, terwijl dode cellen deze functie niet hebben. Het oplossen van deze kristallen met dimethylsulfoxide (DMSO) en het meten van de absorptie bij specifieke golflengten (zoals 490 nm of 570 nm) op een enzymolester kan indirect het aantal levende cellen weergeven en zo de cytotoxiciteit van het aptameer bepalen. | Hoge gevoeligheid, zuinigheid en gemak | Zware werklast, organische oplosmiddelen kunnen schade aan cellen veroorzaken; alleen de definitieve experimentele resultaten kunnen worden verkregen en het volledige proces van cytotoxiciteit kan niet worden bekeken |
| CCK-8-detectiemethode | Cell Counting Kit-8 (CCK-8) is een zeer gevoelige, niet-radioactieve colorimetrische detectiemethode. CCK-8 bevat WST-8, dat door dehydrogenase in de mitochondriën van levende cellen wordt gereduceerd tot de zeer wateroplosbare oranje methylzan-brandstof. De hoeveelheid geproduceerde mezan-kleurstof is lineair gerelateerd aan het aantal levende cellen. Het aantal levende cellen kan indirect worden gereflecteerd door de lichtabsorptiewaarde van de mezan-kleurstof te meten bij een golflengte van 450 nm, om zo de cytotoxiciteit van het aptameer te evalueren. | Eenvoudige bediening, geen noodzaak om cellen te wassen, snelle detectie, breed lineair detectiebereik, hoge gevoeligheid, goede herhaalbaarheid, weinig cytotoxiciteit | Hoge reagensprijs; Soms is het moeilijk te zeggen of de verminderde absorptie het gevolg is van een afname van het aantal levende cellen of een afname van de activiteit van de celdehydrogenase zelf. |
| LDH-detectiemethode | LDH (lactaatdehydrogenase) is een enzym dat stabiel is in het cytoplasma van cellen. Wanneer het celmembraan beschadigd raakt, komt LDH buiten de cel vrij. LDH kan melkzuur katalyseren tot pyruvaat en reageren met INT (tetrazoliumzouten) tot een paarse kristallijne substantie. Door de absorptie ervan bij een specifieke golflengte (zoals 490 nm) te meten, kan de mate van celbeschadiging worden gemeten en vervolgens de cytotoxiciteit van het aptameer worden geëvalueerd. | Het weerspiegelt direct het sterftecijfer van cellen, heeft minder schade aan cellen en er is geen radioactieve isotopenverontreiniging | De noodzaak om de cellen regelmatig uit de incubator te halen, maakt de operatie ingewikkelder; alleen de uiteindelijke experimentele resultaten kunnen worden verkregen en het volledige proces van cytotoxiciteit kan niet worden bekeken |
| Realtime Live Cell Imaging-analyse | Met behulp van een realtime live cell imaging analyzer werd het instrument in de incubator geplaatst om het hele proces van de celgroeicyclus in realtime te observeren en vast te leggen. De cytotoxiciteit van aptameren kan worden geëvalueerd door de morfologische veranderingen en groeicurven van cellen te analyseren. Deze methode kan video- en gekwantificeerde resultaten van cytotoxische processen opleveren, terwijl de celgroeiomgeving stabiel blijft. | Het kan het cytotoxische proces in realtime bewaken, maakt niet-destructieve beelden en vermindert de interferentie en schade aan cellen. Zowel video- als gekwantificeerde resultaten zijn beschikbaar voor diepgaande analyse. | De kosten voor de apparatuur zijn hoog en vereisen professionele bedieningsvaardigheden en het vermogen tot data-analyse. |
KACHI
Voordelen van Aptamer Research Service
Totale kwaliteitscontrole
Geoptimaliseerde aptameren met hogere stabiliteit
Economisch en efficiënt. Concurrerende prijs, betere service.
Uitgebreide onderzoekslocaties en meerdere onderzoeksmethoden
Professionele pre-sales consultatie en after-sales ondersteuningsdiensten
Rijke ervaring in aptameeranalyse
Hoogwaardig R&D-team
Op maat gemaakte aptamer-gerelateerde diensten
Indien u vragen heeft, kunt u te allen tijde contact met ons opnemen.
Leave Your Message
2018-07-16 
0102