In 1960 werd het concept van bispecifieke antilichamen geïntroduceerd. Bispecifieke antilichamen, ook wel bispecifieke monoklonale antilichamen genoemd, zijn kunstmatig gesynthetiseerde antilichamen die met behulp van genetische modificatietechnologie worden geproduceerd. Als een kunstmatig gemanipuleerd antilichaam behoren bispecifieke antilichamen doorgaans tot de IgG-subklasse en bevatten ze een antigeenbindend fragment dat zich richt op de CD3-subeenheid. Bispecifieke antilichamen hebben twee specifieke antigeenbindende plaatsen die tegelijkertijd twee verschillende antigenen, of twee verschillende epitopen van een antigeen, kunnen binden en herkennen. In vergelijking met monoklonale antilichamen hebben bispecifieke antilichamen een extra specifieke antigeenbindende plaats, waardoor ze een sterkere specificiteit en gerichtheid bezitten. Dit maakt een nauwkeurigere targeting van tumorcellen mogelijk en vermindert toxiciteit buiten het doelwit. Bispecifieke antilichamen kunnen tegelijkertijd meerdere biologische functies uitvoeren, zoals het rekruteren van immuuncellen, het blokkeren van signaalroutes en het rechtstreeks doden van tumorcellen. Vroege bispecifieke antilichamen werden voornamelijk bereid via chemische conjugatie of celfusie, maar deze methode heeft zich mogelijk langzaam ontwikkeld vanwege de willekeurige combinaties en de moeilijkheid om de gewenste combinatie te isoleren. Met de voortdurende ontwikkeling van genetische manipulatietechnologie zijn er veel nieuwe technologieplatformen ontwikkeld, zoals knots in holes (KIH), CrossMab, DVD Ig, enzovoort. Deze platforms lossen effectief problemen op zoals mismatches tussen zware en lichte ketens en verbeteren de uniformiteit en opbrengst van bispecifieke antilichamen.

De belangrijkste methoden voor de productie van bispecifieke antilichamen omvatten chemische koppeling, vierbronnenhybridoma en genetische modificatie van antilichamen. Bij de chemische koppelingsmethode worden twee intacte IgG- of twee F(ab')2-antilichaamfragmenten gekoppeld tot bispecifieke antilichamen met behulp van chemische koppelingsmiddelen zoals ftalimimide en dithioacylbenzoëzuur. Deze methode is eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren, maar kan de antigeenbindingsplaats beschadigen, de antilichaamactiviteit verminderen en het koppelingsmiddel zelf heeft bovendien een zekere mate van kankerverwekkendheid. De vierbronnenhybridoma-methode is gebaseerd op de fusie van somatische cellen van twee verschillende hybridoma-cellijnen om het overeenkomstige muizen-IgG tot expressie te brengen. Door middel van genetische modificatie kunnen antilichamen genetisch gemodificeerd worden om bispecifieke antilichamen te vormen. Twee verschillende monoklonale antilichamen worden geconstrueerd en de Fab-fragmenten of de variabele regio's van de zware en lichte keten van de twee antilichamen worden afzonderlijk gesplitst. Door middel van een crosslinkingreactie of ketenrecombinatietechnologie worden de twee fragmenten gecombineerd tot een bispecifiek antilichaam. Hoewel genetische manipulatietechnologie relatief complex is, is het momenteel de meest gebruikte methode voor de productie van bispecifieke antilichamen om de structuur en functie van antilichamen aan te passen. Bij het ontwerpen van bispecifieke antilichamen kan het principe van kruisreactiviteit worden benut, maar kruisreactiviteit kan leiden tot niet-specifieke reacties. Daarom moet hier in de praktijk, bijvoorbeeld bij bispecifieke antilichaamtherapie, zorgvuldig rekening mee worden gehouden.

De zuivering van bispecifieke antilichamen is het proces waarbij zeer zuivere doelantilichamen worden geïsoleerd en gezuiverd. Twee methoden, centrifugatie en diepe filtratie, worden gebruikt om oplosbare onzuiverheden te verwijderen. Het doelbispecifieke antilichaam wordt eerst afgevangen door middel van affiniteitschromatografie. Voor IgG-achtige bispecifieke antilichamen wordt proteïne A-affiniteitschromatografie gebruikt, terwijl voor niet-IgG-achtige bispecifieke antilichamen affiniteitschromatografie op basis van de lichte keten kan worden toegepast. Vervolgens wordt het antilichaam gedurende een bepaalde tijd geïncubeerd onder omstandigheden met een lage pH, waardoor de eiwitstructuur op het oppervlak van de virusenvelop wordt verstoord en het vermogen om cellen te infecteren verloren gaat. Tussentijdse diepe filtratie wordt uitgevoerd om onzuiverheden zoals gastheercelproteïnen (HCP) verder te verwijderen. De zuiverheid van de antilichamen wordt verbeterd door methoden zoals ionenwisselingschromatografie, en eventuele resterende virussen worden verwijderd door middel van nanofiltratie of ultrafiltratie. Ten slotte wordt het monster geconcentreerd en vervangen door een geschikte formuleringbuffer.