Bouwservice voor faagdisplaybibliotheken

Alpha Lifetech is al vele jaren intensief betrokken bij faagdisplaytechnologie. Het bedrijf heeft een perfect stabiel faagdisplaytechnologieplatform ontwikkeld dat tijd bespaart bij wetenschappelijk onderzoek of projectontwikkeling en de daaropvolgende productie vergemakkelijkt. Alpha Lifetech kan klanten ook diensten aanbieden zoals de productie van VHH-antilichamen, SCFV-antilichamen en Fab-antilichamen.

Alpha Lifetech beschikt over een uitgebreid M13/T7-faagdisplayplatform voor de constructie en productie van antilichaambibliotheken. We bieden ook maatwerkdiensten aan, zoals de productie van scFv-antilichamen en high-throughput antilichaamscreening, om aan uw specifieke behoeften te voldoen.

Inleiding tot faagdisplay

Fagedisplaytechnologie is een techniek die fagen (een virus dat bacteriën infecteert) gebruikt om functionele bindingsmoleculen van specifieke eiwitten of peptiden op te sporen. Technieken voor de constructie van fage-antilichaambibliotheken omvatten onder andere de constructie van Fab-antilichaambibliotheken, scFv-antilichaambibliotheken en nanobodybibliotheken. Afhankelijk van het type bacteriofaag kunnen deze worden onderverdeeld in M13, T7, T4, λ en andere systemen. Afhankelijk van het type bibliotheek kunnen deze worden onderverdeeld in willekeurige peptidebibliotheken, cDNA-bibliotheken, antilichaambibliotheken en eiwitbibliotheken. Fagedisplaytechnologie is eenvoudig te bedienen en goedkoop in gebruik. Deze techniek beperkt echter de diversiteit van de moleculaire genetica in de bibliotheek, omdat deze geen al te lange sequenties kan weergeven.

De faagdisplaytechnologie wordt momenteel veelvuldig gebruikt. Er zijn aanzienlijke successen geboekt op het gebied van onderzoek en ontwikkeling van nieuwe vaccins (goedkope en efficiënte synthetische vaccins), de ontwikkeling van antilichaamgeneesmiddelen (screening van enzymremmers), celsignaaltransductie (screening van gesimuleerde epitopen) en onderzoek naar antigeenepitopen (bereiding van monoklonale antilichamen).

Inleiding tot de T7-bacteriofaag

De T7-bacteriofaag bestaat uit dubbelstrengs DNA van 40 kb, dat is omhuld door een capside met een diameter van 60 nm. De verbinding tussen de kop en de staart is een ringstructuur die is opgebouwd uit meerdere kopieën van gp8. De kop en de kern van de T7-bacteriofaag vormen een cilindrische structuur die zich bindt aan gp8 en de kop en de staart met elkaar verbindt.

Figuur 1. Schematische weergave van de T7-bacteriofaag.(Referentie: Vooruitgang in het T7-faagdisplaysysteem (Review))

Inleiding tot de M13-bacteriofaag

De bacteriofaag M13 behoort tot een groep draadvormige fagen die gezamenlijk Ff-fagen worden genoemd. Hij heeft een lengte van 900 nm en een breedte van 6,5 nm. Het genoom bestaat uit enkelstrengs DNA (ssDNA) met een lengte van 6407 bp en bevat negen genen die coderen voor elf verschillende eiwitten. Vijf van deze eiwitten zijn coat-eiwitten en zes eiwitten zijn betrokken bij de replicatie en assemblage van de faag. De hoogste concentratie coat-eiwitten is te vinden in het capside-eiwit G8P, dat is opgebouwd uit ongeveer 2700 eiwiteenheden en een omhulsel vormt rond het chromosoom.

Figuur 2. Schematische weergave van de bacteriofaag M13.(Referentie: Basisprincipes van antilichaam-faagdisplaytechnologie)

Inleiding tot de fagedisplay-antilichaambibliotheek

De ontdekking van antilichamen is steeds belangrijker geworden in de moderne geneeskunde. Er bestaan verschillende methoden voor het ontdekken van antilichamen, maar de fagedisplay-antilichaambibliotheek wordt het meest gebruikt in de medische wetenschap.

Sinds 1990 zijn verschillende antilichaamformaten gebruikt voor de constructie van faagbibliotheken, waaronder VH's, VHH's, scFv's, diabodies en Fab-antilichamen. De scFv, samengesteld uit de structurele domeinen VH en VL, zijn enkelstrengs antilichamen die worden gebruikt voor de constructie van scFv-antilichaambibliotheken. scFv's worden gekenmerkt door een korte halfwaardetijd en lage immunogeniteit. Fab-antilichaambibliotheken bestaan uit VH, VL, CL en CH1, waarmee snel ideale antilichamen met een hoge affiniteit kunnen worden geselecteerd. De kleinste eenheid die het doelantigeen kan binden – VHH – vormt momenteel de basis van de nanobodybibliotheek. VHH heeft als voordelen een eenvoudige structuur, een klein volume, een hoge oplosbaarheid, een goede stabiliteit en een gemakkelijke bereiding en expressie. Synthetische nanobodybibliotheken (Nb-bibliotheken) komen steeds meer naar voren als een aantrekkelijk alternatief voor dierlijke immunisatie vanwege de stabiele, hoog-affiniteit synthetische nanobody. Over het algemeen worden deze antilichaamfragmenten gefuseerd aan de G3P van de M13-faag, en door grote aantallen genen te klonen die coderen voor een antilichaamfragment, kunnen grote faagdisplay-antilichaambibliotheken worden gegenereerd waaruit veel verschillende antilichamen kunnen worden geselecteerd.

Proces voor het opbouwen van een fagenbibliotheek

Het proces voor het construeren van een fagenbibliotheek verloopt als volgt: specifieke primers worden ontworpen voor PCR-amplificatie, waarmee de producten worden verkregen. Deze producten worden enzymatisch geligeerd met de T7/M13-faagvector, waarna het recombinante fagenplasmide succesvol wordt geconstrueerd. Het recombinante fagenplasmide wordt getransformeerd in TG1-receptorcellen, vervolgens gecoat op een medium met geschikte antibiotica, en na screening van de transformanten wordt een kweek uitgevoerd. Na meerdere kweekrondes repliceert de faag zich meerdere malen in de bacteriën en brengt het het doelwitproteïne of -polypeptide succesvol tot expressie. Vervolgens wordt de fagenbibliotheek gezuiverd om onzuiverheden en niet-gebonden fagen te verwijderen.

Variabele regio's (VH en VL) correleerden met de diversiteit van antilichamen, en VH en VL werden samen met een sequentie die codeert voor het faagproteïne PIII in de faagvector ingevoegd. Na de assemblage wordt het faagdeeltje blootgesteld en gefuseerd met het N-terminale deel van het kleine coatproteïne III om een functioneel antilichaamfragment te vormen, waarmee een bibliotheek met de DNA-sequentie van het antilichaam wordt verkregen.

Na afloop van de immunisatie werd de titer bepaald en werd bloed afgenomen van de dieren nadat de titer was vastgesteld. Lymfocyten werden uit het bloed geïsoleerd, RNA werd geëxtraheerd, RT-PCR werd gebruikt om het doelfragment te amplificeren en zo werd het V-regio-genfragment verkregen. Het V-gen werd vervolgens geamplificeerd met behulp van een specifieke primer.

De natuurlijke bibliotheken die gecreëerd zijn, bevatten onder andere zwak immunogene antilichamen in dieren die zich op elk willekeurig doelwit kunnen richten. Faagantilichamen die specifiek aan het antigeen binden, kunnen worden verzameld met behulp van screeningstechnieken die het antigeen fixeren of labelen.

Het doelantigeen wordt gefixeerd op een vaste drager, zoals een gaatje in een microplaat, of gekoppeld aan een magnetische kraal. Vervolgens wordt de fagenantilichaambibliotheek toegevoegd om deze aan het antigeen te binden. Na meerdere eluties worden de fagen met lage affiniteit of niet-specifieke fagen weggewassen en blijven de fagen met specifieke antilichamen over.

Toepassing van faagdisplay

*De ontdekking van antilichamen is steeds belangrijker geworden in de moderne geneeskunde. Er bestaan verschillende methoden voor de ontdekking van antilichamen, maar faagdisplaytechnologie wordt het meest gebruikt in de medische wetenschap. Sinds 1990 zijn verschillende antilichaamformaten gebruikt om faagbibliotheken samen te stellen, waaronder VHs, VHHs, scFvs, diabodies en Fab-antilichamen.
*Fagepeptidebibliotheken maken de snelle bepaling van de sequentie van eiwitepitopen mogelijk en zijn een krachtig hulpmiddel geworden voor het onderzoeken van de interactie tussen epitopen en antigeenreceptoren.
*Antilichaamfragmenten worden gefuseerd aan de G3P van de M13-faag, en door grote aantallen genen te klonen die coderen voor een antilichaamfragment, kunnen grote faagdisplay-antilichaambibliotheken worden gegenereerd waaruit veel verschillende antilichamen kunnen worden geselecteerd.
Het T7-faagdisplaysysteem heeft vele voordelen, waaronder eenvoud, hoge veiligheid, stabiliteit, gemakkelijke opslag en transport, waardoor het systeem wordt gebruikt bij preventieve en therapeutische vaccins.
Het T7-faagdisplaysysteem kan verschillende antigenen detecteren, zoals oppervlakteantigenen van pathogene micro-organismen en kankerantigenen.

faag