Faag Display Bibliotheek Screening Service

Alpha Lifetech is al jarenlang nauw betrokken bij faagdisplaytechnologie. Het bedrijf heeft een perfect stabiel faagdisplaytechnologieplatform ontwikkeld dat tijd bespaart bij wetenschappelijk onderzoek of projectonderzoek en de daaropvolgende productie vergemakkelijkt. Alpha Lifetech kan klanten ook diensten leveren zoals de productie van VHH-antilichamen, SCFV-antilichamen en Fab-antilichamen.

Alpha Lifetech beschikt over een uitgebreid M13/T7-faagdisplayplatform om de constructie en productie van antilichaambibliotheken te garanderen. We kunnen ook maatwerkdiensten leveren, zoals de productie van antilichaam-scFv en high-throughput antilichaamscreening, om aan uw behoeften te voldoen.

Proces voor de constructie van fagendisplaybibliotheken

Het proces van faagbibliotheekconstructie verloopt als volgt: er worden specifieke primers ontworpen voor PCR-amplificatie die de producten oplevert, die enzymgeligeerd zijn met de T7/M13-faagvector, en het recombinante faagplasmide wordt succesvol geconstrueerd. Het recombinante faagplasmide werd getransformeerd in TG1-receptorcellen, vervolgens gecoat op een medium met geschikte antibiotica, en na screening van de transformatoren werd een uitgebreide kweek uitgevoerd. Na meerdere kweekrondes repliceert de faag de replicatietijden in de bacteriën en brengt het met succes het doeleiwit of -polypeptide tot expressie. Vervolgens wordt de faagbibliotheek gezuiverd om enkele onzuiverheden en ongebonden fagen te verwijderen.

Methoden voor screening van fagendisplaybibliotheken

Het succes van de productie van fagedisplay-antilichamen hangt voornamelijk af van de fagedisplaybibliotheken. De meest gebruikte methoden voor fagepanning zijn screening in vaste fase en in vloeistoffase. Screening in vaste fase verrijkt specifieke antilichamen door middel van 3-4 elutierondes om fagedisplaybibliotheken te verkrijgen. Screening in vloeistoffase wordt uitgevoerd door biotine-gelabelde target- en fagedisplaybibliotheken te incuberen en gebonden fagen te vangen met magnetische beads. Screening in vaste fase verbruikt meer antigeen en sommige antigeenepitopen worden vernietigd. Screening in vloeistoffase wordt gekenmerkt door een hoge efficiëntie en verrijking, maar de verkregen antilichamen zijn minder specifiek. De methode voor fagepanning hangt af van de experimentele behoeften, die allemaal een zekere impact zullen hebben op het effect van de productie van fagedisplay-antilichamen.

High Throughput Antilichaam Screening

De ontwikkeling van antilichamen is in de moderne geneeskunde razendsnel gegaan. Er bestaan verschillende methoden voor de ontwikkeling van antilichamen, maar high-throughput antilichaamscreening wordt vaker gebruikt in de medische wetenschap. Het proces kan een grote diversiteit aan antilichaamrepertoires bereiken. Combinatie met traditionele antilichaambibliotheekscreeningmethoden kan de screeningkwaliteit van fagedisplaybibliotheken verbeteren. Na biologische screening kunnen antilichamen worden gekarakteriseerd met low-throughput ELISA of high-throughput antilichaamscreening.

Figuur 1 Stroomdiagram waarin de volgorde van gebeurtenissen wordt weergegeven, van de constructie van fage-antilichaambibliotheken tot de generatie van monoklonale antilichamen met een hoge affiniteit voor antigenen en een lage immunogeniciteit.(Referentiebron:Faagdisplaytechnologie als krachtig platform voor de ontdekking van antilichaammedicijnen- PMC (nih.gov)

Voorzorgsmaatregelen voor antilichaamfaagdisplayscreeningVoorzorgsmaatregelen

Bufferoverwegingen

Bij de keuze van buffers moet rekening worden gehouden met de stabiliteit van het doelwit, de bindende micro-omgeving en minimale niet-specifieke binding in het daadwerkelijke toepassingsscenario. Niet-verwante eiwitten, niet-ionische detergenten en fysiologische zoutconcentraties dragen bij aan het verminderen van de achtergrond. Er zijn ook andere omstandigheden, zoals de toevoeging van bivalente kationen of andere cofactoren aan de buffer voor sommige targets. Eiwitcofactoren kunnen samen met het doelwit worden gefixeerd, aan de sorteerbuffer worden toegevoegd en zelfs worden gebruikt om het doelwit te vangen.

Drukoverwegingen

Algemene overwegingen met betrekking tot selectiedruk zijn onder meer de concentratie van doelmoleculen, bindingstijd, wasintensiteit, enz. Andere technieken om de selectiedruk te verhogen, zijn onder meer het gebruik van denatureringsmiddelen (zoals zuren, ureum en guanidine), organische oplosmiddelen, het verhogen van de temperatuur of het verhogen van de concentratie van concurrerende liganden of doelen in de wasbuffer.
De eerste screeningsronde is hierbij van belang. De eerste screeningsronde is bedoeld om zoveel mogelijk positieve klonen uit de geconstrueerde bibliotheek te halen en niet-specifieke klonen te verwijderen. Poreus gecoate targets of een groot aantal oplosbare targets moeten worden gebruikt om ervoor te zorgen dat een groot aantal gebonden fagen wordt gevangen en de diversiteit van de bibliotheek behouden blijft. In volgende screeningsrondes moet de selectiedruk worden verhoogd door de verrijking te verhogen, meerdere keren te wassen en de wastijd te verlengen. Zo kunnen klonen met een hoge affiniteit worden gescreend.

Negatieve screeningstrategie

Antigeentags en dragermaterialen: het screeningsproces bestaat uit het screenen op alle stoffen op de antigeenconjugaten, zoals tags, fusie-eiwitten en ondersteunende substraten. Negatieve screening van niet-doelwitantistoffen kan de verrijking van andere antilichamen dan het doelantigeen beperken.
Hele cellen, liposomen, nano-fosfolipide-schijven en VLP's kunnen negatief worden gescreend met behulp van gesimuleerde getransfecteerde cellen of niet-getransfecteerde cellen bij het screenen van getransfecteerde cellijnen.
Verwijdering van complexe antigeenmengsels Strikte negatieve screening kan worden uitgevoerd voor onbekende of complexe doelmoleculen, zoals hele cellen of onzuivere eiwitten.
De strategie van antilichamen is gericht tegen specifieke plaatsen van antigenen. De ene is om het antilichaam dat kan concurreren met de ligand te verwijderen door een hoge concentratie liganden toe te voegen, en de andere is om het antilichaam te blokkeren.

Toepassing van fagedisplay

*Het ontdekken van antilichamen is steeds belangrijker geworden in de moderne geneeskunde. Er bestaan verschillende methoden voor het ontdekken van antilichamen, maar faagdisplaytechnologie wordt vaker gebruikt in de medische wetenschap. Sinds 1990 worden verschillende antilichaamformaten gebruikt om faagbibliotheken te construeren, waaronder VH's, VHH's, scFv's, diabodies en Fab-antilichamen.
*Faagpeptidebibliotheken maken het mogelijk om snel de sequentie van proteïne-epitopen te bepalen en zijn een krachtig hulpmiddel geworden voor het onderzoeken van de interactie tussen epitopen en antigeenreceptoren.
*Antilichaamfragmenten worden gefuseerd aan de G3P van de M13-faag. Door het klonen van grote aantallen genen die coderen voor een antilichaamfragment, kunnen grote fagedisplay-antilichaambibliotheken worden gegenereerd waaruit veel verschillende antilichamen kunnen worden geselecteerd.
*Het T7-faagdisplaysysteem kent vele voordelen, waaronder eenvoud, hoge veiligheid, stabiliteit, gemakkelijke opslag en transport. Daarom wordt het systeem gebruikt voor preventieve en therapeutische vaccins.
*Het T7-faagdisplaysysteem kan verschillende antigenen detecteren, zoals oppervlakteantigenen van pathogene micro-organismen en kankerantigenen.

Faag