Screeningservice voor faagdisplaybibliotheken

Alpha Lifetech is al vele jaren intensief betrokken bij faagdisplaytechnologie. Het bedrijf heeft een perfect stabiel faagdisplaytechnologieplatform ontwikkeld dat tijd bespaart bij wetenschappelijk onderzoek of projectontwikkeling en de daaropvolgende productie vergemakkelijkt. Alpha Lifetech kan klanten ook diensten aanbieden zoals de productie van VHH-antilichamen, SCFV-antilichamen en Fab-antilichamen.

Alpha Lifetech beschikt over een uitgebreid M13/T7-faagdisplayplatform voor de constructie en productie van antilichaambibliotheken. We bieden ook maatwerkdiensten aan, zoals de productie van scFv-antilichamen en high-throughput antilichaamscreening, om aan uw specifieke behoeften te voldoen.

Constructieproces van een faagdisplaybibliotheek

Het proces voor het construeren van een fagenbibliotheek verloopt als volgt: specifieke primers worden ontworpen voor PCR-amplificatie, waarmee de producten worden verkregen. Deze producten worden enzymatisch geligeerd met de T7/M13-faagvector, waarna het recombinante fagenplasmide succesvol wordt geconstrueerd. Het recombinante fagenplasmide wordt getransformeerd in TG1-receptorcellen, vervolgens gecoat op een medium met geschikte antibiotica, en na screening van de transformanten wordt een kweek uitgevoerd. Na meerdere kweekrondes repliceert de faag zich meerdere malen in de bacteriën en brengt het het doelwitproteïne of -polypeptide succesvol tot expressie. Vervolgens wordt de fagenbibliotheek gezuiverd om onzuiverheden en niet-gebonden fagen te verwijderen.

Screeningmethoden voor faagdisplaybibliotheken

Het succes van de productie van antilichamen met behulp van faagdisplay hangt voornamelijk af van de faagdisplaybibliotheken. De meest gebruikte methoden voor faagselectie zijn screening in de vaste fase en screening in de vloeibare fase. Bij screening in de vaste fase worden specifieke antilichamen verrijkt door middel van 3-4 elutierondes, waarmee faagdisplaybibliotheken met antilichamen worden verkregen. Bij screening in de vloeibare fase worden biotine-gelabelde doelwitten en faagdisplaybibliotheken met antilichamen geïncubeerd, waarna de gebonden fagen worden opgevangen met behulp van magnetische kralen. Screening in de vaste fase verbruikt meer antigeen en sommige antigeenepitopen worden vernietigd. Screening in de vloeibare fase kenmerkt zich door een hoge efficiëntie en verrijking, maar de verkregen antilichamen zijn minder specifiek. De methode voor faagselectie hangt af van de experimentele behoeften en heeft een zekere invloed op het resultaat van de faagdisplay-antilichaamproductie.

Screening van antilichamen met hoge doorvoer

De ontwikkeling van antilichamen heeft zich in de moderne geneeskunde snel ontwikkeld. Er bestaan verschillende methoden voor antilichaamontwikkeling, maar high-throughput antilichaamscreening wordt het meest gebruikt in de medische wetenschap. Dit proces kan een grote diversiteit aan antilichaamrepertoire opleveren. Door de screening te combineren met traditionele methoden voor het screenen van antilichaambibliotheken kan de kwaliteit van de screening met behulp van faagdisplaybibliotheken worden verbeterd. Na de biologische screening kunnen antilichamen worden gekarakteriseerd met behulp van low-throughput ELISA of high-throughput antilichaamscreening.

Figuur 1. Stroomschema dat de opeenvolging van gebeurtenissen schetst, van de constructie van faag-antilichaambibliotheken tot de generatie van monoklonale antilichamen met een hoge affiniteit voor antigenen en een lage immunogeniteit.(Bronverwijzing: Fage-displaytechnologie als krachtig platform voor de ontdekking van antilichaamgeneesmiddelen - PMC (nih.gov))

Voorzorgsmaatregelen bij screening met behulp van antilichaam-faagdisplayVoorzorgsmaatregelen

Overwegingen met betrekking tot buffers

Bij de keuze van buffers moet rekening worden gehouden met de stabiliteit van het doelwit, de bindingsmicroomgeving en minimale niet-specifieke binding in het daadwerkelijke toepassingsscenario. Niet-verwante eiwitten, niet-ionische detergenten en fysiologische zoutconcentraties dragen bij aan het verminderen van de achtergrondruis. Er zijn ook andere factoren waarmee rekening moet worden gehouden; sommige doelwitten vereisen bijvoorbeeld de toevoeging van tweewaardige kationen of andere cofactoren aan de buffer. Eiwitcofactoren kunnen samen met het doelwit worden gefixeerd, aan de sorteerbuffer worden toegevoegd en zelfs worden gebruikt als middel om het doelwit te vangen.

Drukoverwegingen

Factoren die vaak een rol spelen bij het bepalen van de selectiedruk zijn onder andere de concentratie van de doelmoleculen, de bindingstijd en de wasintensiteit. Andere technieken om de selectiedruk te verhogen zijn het gebruik van denatureringsmiddelen (zoals zuren, ureum en guanidine), organische oplosmiddelen, een hogere temperatuur of een hogere concentratie van concurrerende liganden of doelmoleculen in de wasbuffer.
De eerste screeningsronde is daarbij cruciaal. Het doel van deze eerste ronde is om zoveel mogelijk positieve klonen uit de geconstrueerde bibliotheek te selecteren en tegelijkertijd niet-specifieke klonen te verwijderen. Poreus gecoate targets of een groot aantal oplosbare targets moeten worden gebruikt om ervoor te zorgen dat een groot aantal gebonden fagen wordt opgevangen en de diversiteit van de bibliotheek behouden blijft. In de daaropvolgende screeningsrondes moet de selectiedruk worden verhoogd door middel van verrijking, meerdere wasbeurten en een langere wastijd. Op deze manier kunnen klonen met een hoge affiniteit worden geselecteerd.

Negatieve screeningstrategie

Bij de screening van antigeenlabels en dragermaterialen worden alle stoffen op de antigeenconjugaten, zoals labels, fusie-eiwitten en ondersteunende substraten, gecontroleerd. Negatieve screening van niet-doelwitten kan de verrijking van antilichamen anders dan het doelantigeen beperken.
Hele cellen, liposomen, nanofosfolipideschijven en VLP's kunnen negatief worden gescreend met behulp van gesimuleerde getransfecteerde cellen of niet-getransfecteerde cellen bij het screenen van getransfecteerde cellijnen.
Verwijdering van complexe antigeenmengsels. Strikte negatieve screening kan worden uitgevoerd voor onbekende of complexe doelmoleculen, zoals hele cellen of onzuivere eiwitten.
De strategie van antilichamen tegen specifieke bindingsplaatsen van antigenen is tweeledig: enerzijds het elueren van het antilichaam dat kan concurreren met de ligand door een hoge concentratie liganden toe te voegen, en anderzijds het blokkeren van het antilichaam.

Toepassing van faagdisplay

*De ontdekking van antilichamen is steeds belangrijker geworden in de moderne geneeskunde. Er bestaan verschillende methoden voor de ontdekking van antilichamen, maar faagdisplaytechnologie wordt het meest gebruikt in de medische wetenschap. Sinds 1990 zijn verschillende antilichaamformaten gebruikt om faagbibliotheken samen te stellen, waaronder VHs, VHHs, scFvs, diabodies en Fab-antilichamen.
*Fagepeptidebibliotheken maken de snelle bepaling van de sequentie van eiwitepitopen mogelijk en zijn een krachtig hulpmiddel geworden voor het onderzoeken van de interactie tussen epitopen en antigeenreceptoren.
*Antilichaamfragmenten worden gefuseerd aan de G3P van de M13-faag, en door grote aantallen genen te klonen die coderen voor een antilichaamfragment, kunnen grote faagdisplay-antilichaambibliotheken worden gegenereerd waaruit veel verschillende antilichamen kunnen worden geselecteerd.
Het T7-faagdisplaysysteem heeft vele voordelen, waaronder eenvoud, hoge veiligheid, stabiliteit, gemakkelijke opslag en transport, waardoor het systeem wordt gebruikt bij preventieve en therapeutische vaccins.
Het T7-faagdisplaysysteem kan verschillende antigenen detecteren, zoals oppervlakteantigenen van pathogene micro-organismen en kankerantigenen.

faag