Analyseservice voor eiwit-eiwitinteracties
Alpha Lifetech kan klanten ook voorzien van eiwitanalyses, eiwitinteractieanalyses, eiwit-eiwitinteractieanalyses (CO-IP, Western Blot, chromatine-immunoprecipitatieanalyse) en eiwitfunctieanalyses om te voldoen aan de experimentele behoeften van verschillende klanten.
NEEM CONTACT MET ONS OP01
Analyseservice voor eiwit-eiwitinteracties
Alpha Lifetech is al vele jaren intensief betrokken bij eiwitanalyses, heeft een solide platform voor eiwitfunctieanalyses opgebouwd en diverse technische methoden ontwikkeld om eiwitinteracties te verifiëren. Dit bespaart tijd bij wetenschappelijk onderzoek en levert tegelijkertijd betrouwbare resultaten op.
Alpha Lifetech kan klanten ook voorzien van eiwitanalyses, eiwitinteractieanalyses, eiwit-eiwitinteractieanalyses (CO-IP, Western Blot, chromatine-immunoprecipitatieanalyse) en eiwitfunctieanalyses om te voldoen aan de experimentele behoeften van verschillende klanten.
Inleiding tot de eiwit-eiwitinteractietest
Eiwitten zijn de meest cruciale uitvoerende moleculen in elke levensvorm en reageren op de instructies die zijn opgeslagen in genetisch materiaal. Vaker nog vervullen eiwitten hun functie door als rolspelers op te treden en met andere eiwitten te interageren, wat duidelijker wordt wanneer de functie van een eiwit in de daadwerkelijke context van een cel wordt onderzocht. Het identificeren van de interacties tussen eiwitten is cruciaal voor biochemisch onderzoek naar een individueel eiwit. Voorbeelden van veelvoorkomende eiwitinteractieanalyses zijn:
Co-immunoprecipitatie-assay
Het principe van de co-immunoprecipitatiemethode is het mengen van het doelwitproteïne, het specifieke antilichaam en proteïne A/G-magnetische kralen voor incubatie. Het supernatant met het niet-gebonden proteïne wordt verwijderd door adsorptie van de magnetische kralen aan een magnetisch rek, waarna de magnetische kralen worden gewassen om het proteïne en andere onzuiverheden te verwijderen, tenzij deze specifiek gebonden zijn.
Figuur 1. Schematisch diagram van Co-IP-assays.(Bronverwijzing: Co-immunoprecipitatie-assay - PubMed (nih.gov))
Pull-down-assay
Bij de pull-down-assay wordt een bekend eiwit aan een magnetische kraal bevestigd en wordt de te detecteren stof toegevoegd. Het eluaat wordt vervolgens geanalyseerd op de adsorptie van interagerende eiwitten.
In 1988 zuiverden Smith et al. het GST-fusie-eiwit, dat werd toegepast in pull-down-assays. Deze methode, GST pull-down genoemd, houdt in dat een GST-label aan het doeleiwit wordt toegevoegd, het interagerende eiwit wordt opgevangen met behulp van GSH, de binding wordt geëlueerd en vervolgens geverifieerd met behulp van Western Blot-assays.
Figuur 2. Schematisch diagram van GST-pulldown-assays.(Bronverwijzing: GST Pull-Down Assay om PIF4-binding in vitro te bestuderen - PubMed (nih.gov) )
Zijn pull-down-methode maakt gebruik van metaalionen zoals nikkel of kobalt als medium, zuivert het eiwit via affiniteitschromatografie en elueert de binding via een Western Blot-experiment ter verificatie.
Daarnaast zijn er DNA-pulldown (eiwit-DNA-bindingsassay), RNA-pulldown (eiwit-RNA-interactieassay) en pulldown-assays voor kleine moleculen.
DNA-pulldown (eiwit-DNA-bindingsassay) is een in vitro-methode om de DNA-binding van eiwitten te bepalen. Of specifieke eiwitten aan doel-DNA binden, wordt gedetecteerd met behulp van Western Blot-assays; onbekende DNA-fragmenten die aan eiwitten binden, worden geïdentificeerd door middel van massaspectrometrie (MS).
RNA-pulldown (eiwit-RNA-interactie-assay) is een in vitro-methode om de binding van RNA aan eiwitten te bepalen. Of specifieke eiwitten binden aan doel-RNA werd gedetecteerd met behulp van Western Blot-assays; onbekende RNA-fragmenten die aan eiwitten binden, en welke RNA-fragmenten dat zijn, werden geïdentificeerd met behulp van massaspectrometrie (MS).
SM pull-down (small molecule pull-down assays) kunnen doelwitproteïnen vinden die specifiek binden aan kleine moleculen. In combinatie met MS kunnen deze doelwitproteïnen nauwkeurig worden gescreend. Deze methode kan worden onderverdeeld in de in vitro labelingsmethode en de biologische orthogonale methode.
WB-experiment
Het Western Blot-experiment (ook bekend als WB-experiment of Western blot) is in essentie de specifieke reactie tussen antigeen en antilichaam. Het basisprincipe is het scheiden van gedenatureerde eiwitten door middel van SDS-polyacrylamidegelelektroforese en het overbrengen ervan naar een vaste fasedrager (zoals een PVDF-membraan of NC-membraan) via membraantransfer (natte of semi-droge rotatie). Na blokkering (met bijvoorbeeld BSA of karnemelk) wordt het primaire antilichaam aangebracht om specifiek aan het eiwit te binden. Na het wassen van de film wordt het met fluoresceïne gelabelde secundaire antilichaam toegevoegd. Door de binding van het secundaire antilichaam met het primaire antilichaam kan het doeleiwit worden waargenomen door de kleurontwikkeling van het substraat en chemiluminescentie. Het wordt over het algemeen gebruikt om te bepalen of een specifiek eiwit in het monster tot expressie komt en om de expressie ervan globaal te analyseren.
Vergelijking van eiwit-eiwitinteractiemethoden
De eiwit-pulldown-assays lijken op de co-immunoprecipitatie-assays (CoIP-assays), die beide behoren tot de methoden voor het detecteren van eiwitinteracties. Het verschil tussen de twee methoden is dat bij CoIP-assays de interagerende eiwitten van bekende eiwitten worden verkregen, wat een zekere mate van betrouwbaarheid heeft, maar niet kan bevestigen of de interagerende eiwitten direct of indirect met elkaar interageren. Pulldown-assays daarentegen zijn bedoeld om een onbekend eiwit te vinden dat interageert met een bekend eiwit. Het kan direct bevestigen of het bekende eiwit interageert met het gedetecteerde eiwit, maar geeft geen inzicht in de bindingssituatie in vivo.
Co-immunoprecipitatietechnologie wordt gebruikt om te analyseren of er een interactie bestaat tussen twee of meer eiwitten, gebaseerd op immunoprecipitatie-experimenten. Vergeleken met andere experimentele technieken voor eiwitinteractieanalyse (GST Pull-down, Western Blot, chromatine-immunoprecipitatie-assay, enz.), heeft co-IP-technologie een hogere specificiteit, gevoeligheid en herhaalbaarheid. Hierdoor wordt interferentie door niet-specifieke bindingen vermeden en worden de interacties tussen eiwitten in hun natuurlijke staat weergegeven.
| GST omlaag trekken | Co-IP | WB | |
|---|---|---|---|
| Voordeel | *Eenvoudig te bedienen *Geschikt voor de zuivering van diverse eiwitten | *Voor in vivo interactieanalyse *Het kan worden geïdentificeerd met een stroomafwaarts gelegen eiwit | *Sterke specificiteit *Kwalitatief en kwantitatief in vitro |
| Beperking | *Mogelijk niet-specifieke binding *Verdere validatie van de interactie is vereist | *Sterke afhankelijkheid van antilichamen *Niet-specifieke binding kan voorkomen | *Tijdrovend *Moeilijk te gebruiken voor grootschalige eiwitanalyse |
| Toepassingsvoorbeeld | *Interacties identificeren *Gezuiverd eiwitcomplex | *Bestudeer signaaltransductie *Ziektemechanisme | Vervolgonderzoek naar interacties tussen eiwitten onderling, tussen eiwitten en DNA, en tussen eiwitten en RNA. |
Op maat gemaakt
Diensten op maat om aan uw behoeften te voldoen.
Ervaring
Jarenlange ervaring in eiwitproductie
Technologie
Hoogwaardige bezorgresultaten
Experimenteel proces
Strikt kwaliteitsmanagementproces
Heeft u vragen? Neem dan gerust contact met ons op.
Leave Your Message
16-07-2018 
0102