Screeningservice voor gistoppervlakte-displaybibliotheken

Alpha Lifetech is gespecialiseerd in de constructie van gistdisplaybibliotheken en het screenen van antilichaambibliotheken. We bieden klanten wereldwijd de mogelijkheid om verschillende soorten gistbibliotheken te genereren en deze te screenen op antilichamen met een hoge affiniteit en specificiteit. Met een team van deskundige onderzoekers, geavanceerde technologie en apparatuur kunnen we gistbibliotheken samenstellen die gericht zijn op een breed scala aan ziektegerelateerde eiwitten. We bieden faagdisplay- en gistdisplaytechnologieën aan, waaronder eiwit-gistdisplay, gistdisplay voor kleine moleculen, antilichaam-gistdisplay, enzovoort.

Onze gistdisplaybibliotheken hebben een grote capaciteit en een hoge diversiteit, wat een solide basis vormt voor de effectieve screening van specifieke antilichaamsequenties. We kunnen verschillende soorten gistdisplaybibliotheken voor antilichamen samenstellen (IgG-, scFv-, VHH- en Fab-antilichaambibliotheken), eiwitbibliotheken, peptidebibliotheken, cDNA-bibliotheken, enzovoort, afhankelijk van uw behoeften. Daarnaast kunnen we ook antilichaambibliotheken met diverse eigenschappen ontwikkelen, waaronder immuunbibliotheken, natuurlijke bibliotheken, synthetische bibliotheken, semi-synthetische bibliotheken en ziekte-antilichaambibliotheken.

Inleiding tot het gistdisplaysysteem

Gistoppervlaktepresentatietechnologie is een methode om recombinante eiwitten op het oppervlak van gistcellen weer te geven door middel van genfusie. Het meest gebruikte gistpresentatiesysteem maakt gebruik van het doeleiwit dat is gefuseerd aan het C-uiteinde van de Aga2p-subeenheid van het alfa-lectine-paringseiwit. Deze fusie bestaat voornamelijk uit epitopen aan beide zijden van het doeleiwit: de N-terminale hemagglutinine (HA)-tag van 9 aminozuren en de C-terminale c-myc-tag van 10 aminozuren. De Aga2p-subeenheid van 69 aminozuren bindt aan de Aga1p-subeenheid van het alfa-lectine van 725 aminozuren via twee disulfidebindingen, en Aga1p is verankerd aan de celwand via een β-1,6-glucaan covalente binding. Het doeleiwit wordt dus op het oppervlak van gistcellen weergegeven en vervolgens herkend door de corresponderende ligand. Functionele eiwitten kunnen uit bibliotheken worden geïsoleerd door middel van flowcytometrische screening.

Figuur 1: Principe van de oppervlaktepresentatie van gistcellen. (Bron afbeelding: Toepassingen van gistoppervlaktepresentatie voor eiwitengineering.)

Inleiding tot de gistoppervlakte-displaybibliotheek

Sortering op basis van gistoppervlakte-expressie is voornamelijk gebruikt voor het screenen van antilichaambibliotheken die gericht zijn op eiwitten aan het celoppervlak. Door de lage niet-specifieke binding tussen gistcellen en andere celoppervlakken kan biologische selectie op basis van gist grote bindingsbibliotheken screenen om zeldzame klonen te vinden.

Screeningservice voor gistoppervlakte-displaybibliotheken

Bereid plasmiden voor en kweek gistcellen, synthetiseer DNA dat codeert voor het doeleiwit en kloon dit in een gistexpressievector die induceerbare promotors, signaalpeptiden en doelgenen bevat, gefuseerd aan oppervlakte-expressie-eiwitten (zoals Aga2p). Het gen dat codeert voor het doeleiwit kan worden gefuseerd met het gen dat codeert voor het gistcelwandeiwit (meestal Aga2p), en het gefuseerde gen kan via elektroporatie in gistcellen worden getransformeerd. Na transformatie kunnen gistcellen die antilichaamgenen op hun oppervlak tot expressie brengen, antigeenspecifieke screeningstests ondergaan: de gistbibliotheek wordt geïncubeerd met het doelantigeen en gistcellen die er specifiek aan binden, worden geselecteerd. Met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) om gistcellen te isoleren die eiwitten met de gewenste eigenschappen tot expressie brengen, kan screening van de gist-expressiebibliotheek worden uitgevoerd met een maximale bibliotheekgrootte van ~10⁸-10⁹ gistcellen. Positieve klonen kunnen vervolgens worden geïsoleerd voor verdere analyse of downstream-toepassingen. Zodra specifieke antilichaamklonen uit de antilichaambibliotheek zijn geïdentificeerd, kunnen ze verder worden gekarakteriseerd, op grote schaal worden geproduceerd en gezuiverd met behulp van technieken zoals proteïne A/G-affiniteitschromatografie, waarmee het hele proces van gistdisplayscreening en antilichaamproductie wordt voltooid.

Proces van screening van een gistdisplaybibliotheek

Figuur 2. Screeningproces van de gist-displaybibliotheek

Werkstroom voor de screeningservice van de gistdisplaybibliotheek

Stappen	Service-inhoud	Tijdlijn
Antigeenbereiding	Antigeentype: Indien de klant antigenen kan aanleveren, dienen overeenkomstige monsters te worden geleverd conform het type: recombinante eiwitten vereisen 3-3,5 mg met een zuiverheidseis van meer dan 85%, kleine moleculen moeten geconjugeerd zijn met een zuiverheidseis van meer dan 90%, peptidesynthese vereist conjugatie met een zuiverheidseis van meer dan 90%, monstertypen zoals virussen moeten worden geïnactiveerd, RNA moet worden gecontroleerd op afbraak, en de bovengenoemde antigeentypen kunnen ook op maat worden gesynthetiseerd.	2-3 weken
Dierlijke immuniteit	Het aantal diervaccinaties bedraagt 5. Op basis van serumtiterbepaling moet worden vastgesteld of het aantal vaccinaties moet worden verhoogd. Antigeenimmuniteit: potentie van eiwit-/virusantigenen > 10⁵; potentie van peptide-/kleine molecuulantigenen > 10⁴	5-6 weken
Template cDNA-voorbereiding	Scheid de plasma-PBMC's, extraheer het totale RNA (RNA-extractiekit) en zet dit om in cDNA.	1 dag
Bibliotheekbouw	Met behulp van cDNA uit een bibliotheek als template werd het VHH-gen geamplificeerd door middel van twee PCR-rondes, waarna een VHH-gen-splicing gist-displayvector werd geconstrueerd. Deze vector werd door middel van elektroporatie in gistcellen getransformeerd om een antilichaambibliotheek te construeren. Er werden willekeurig 48 klonen geselecteerd en het percentage positieve klonen (>90%) werd bepaald met behulp van de PCR-methode. De bibliotheekcapaciteit werd berekend (10^7-10^8), waarna NGS-sequencing werd uitgevoerd om het percentage correcte bibliotheekinserties (>90%) en de bibliotheekdiversiteit te bepalen.	2 weken
Bibliotheekvertoning	Standaard drie screeningsrondes: FACS-screening met fluorescent gelabelde eiwitten, gevolgd door NGS-sequencing in de derde ronde. Positieve klonen werden geselecteerd voor expressie door inductie van één gram en ELISA-detectie. Alle positieve klonen werden geselecteerd voor gensequentiebepaling, waarbij verschillende CDR-regiosequenties werden geselecteerd.	2-3 weken
Antilichaamverificatie	Het construeren van geschikte expressievectoren voor antilichaamsequenties kan de expressie van antilichamen, de zuivering van antilichamen, de ELISA- en BLI-validatie van de antilichaam-antigeenbinding om de antilichaamaffiniteit te verifiëren, en de flowcytometrieblokkade om de celfunctie te valideren vergemakkelijken.	1 week

Casus van screening van een gistoppervlakte-displaybibliotheek

In de literatuur over platforms voor de snelle ontdekking van conformationeel selectieve nanobodies op basis van gistoppervlaktepresentatie, hebben de auteurs een compleet in vitro platform voor de ontdekking van nanobodies ontwikkeld, gebaseerd op gistoppervlaktepresentatie. Allereerst werd een synthetische nanobodybibliotheek ontworpen op basis van kameelgenen. Figuur D laat zien dat de nanobody een HA-tag aan het carboxyluiteinde heeft, waarna de nanobody covalent wordt gefixeerd aan de celwand van de gist. Figuur E toont het screeningsproces van de nanobodies. Gistcellen met antigeen-affiniteitsnanobodies werden geïsoleerd, vermenigvuldigd en herhaaldelijk geselecteerd op antilichamen met behulp van FACS. De auteurs ontdekten via dit platform conformationeel selectieve nanobodies die gericht waren op twee verschillende humane GPCR's.