Screeningdienst voor gistoppervlakte-displaybibliotheek

Alpha Lifetech is gespecialiseerd in de constructie van gistdisplaybibliotheken en het screenen van antilichaambibliotheken. We bieden klanten wereldwijd de mogelijkheid om verschillende vormen van gistbibliotheken te genereren en deze te screenen op antilichamen met hoge affiniteit en specifieke antilichamen. Met een team van deskundige onderzoekers, geavanceerde technologie en apparatuur kunnen we gistbibliotheken samenstellen die gericht zijn op een breed scala aan ziektegerelateerde eiwitten. We kunnen faagdisplay- en gistdisplaytechnologieën leveren, waaronder eiwitgistdisplay, gistdisplay met kleine moleculen, gistdisplay met antilichamen, enzovoort.

Onze gistdisplaybibliotheken hebben een grote capaciteit en een hoge diversiteit, wat een uitstekende basis vormt voor effectieve screening van specifieke antilichaamsequenties. We kunnen verschillende vormen van gistdisplaybibliotheken voor antilichamen (IgG-, scFv-, VHH- en Fab-antilichaambibliotheken), eiwitbibliotheken, peptidebibliotheken, cDNA-bibliotheken, enz. samenstellen, afhankelijk van uw behoeften. Daarnaast kunnen we ook antilichaambibliotheken met verschillende eigenschappen ontwikkelen, waaronder immuunbibliotheken, natuurlijke bibliotheken, synthetische bibliotheken, semi-synthetische bibliotheken en ziekte-antilichaambibliotheken.

Inleiding tot het gistdisplaysysteem

Gistoppervlakdisplaytechnologie is een methode om recombinante eiwitten op het oppervlak van gist te presenteren door middel van genfusie. Het meest voorkomende gistdisplaysysteem maakt gebruik van het doeleiwit dat gefuseerd is aan de C-terminus van de Aga2p-subeenheid van het alfa-lectine-paringseiwit, voornamelijk bestaande uit epitooptags aan beide zijden van het doeleiwit: de N-terminale hemagglutinine (HA)-tag van 9 aminozuren en de C-terminus c-myc-tag van 10 aminozuren. De Aga2p-subeenheid van 69 aminozuren bindt zich via twee disulfidebindingen aan de Aga1p-subeenheid van 725 aminozuren, en Aga1p is via een covalente β1,6-glucaanbinding aan de celwand verankerd. Hierdoor wordt het doeleiwit op het oppervlak van gistcellen gepresenteerd en vervolgens herkend door de corresponderende ligand. Scheid functionele eiwitten uit bibliotheken door middel van flowcytometriescreening.

Figuur 1: Principe van de weergave van gistoppervlakken. (Bron afbeelding:Toepassingen van gistoppervlakdisplays voor eiwittechnologie.)

Inleiding tot de gistoppervlak-displaybibliotheek

Gistdisplaysortering is gebaseerd op gistoppervlakdisplay en wordt voornamelijk gebruikt om antilichaambibliotheken te screenen die gericht zijn op celoppervlakte-eiwitten. Door de lage aspecifieke binding tussen gistcellen en andere celoppervlakken, kan biologische selectie van gist grote bindingsbibliotheken screenen om zeldzame klonen te vinden.

Screeningdienst voor gistoppervlakte-displaybibliotheek

Bereid plasmiden voor en kweek gistcellen, synthetiseer DNA dat codeert voor het doeleiwit en kloon dit in een gistexpressievector met induceerbare promoters, signaalpeptiden en doelgenen gefuseerd aan oppervlakte-display-eiwitten (zoals Aga2p). Het gen dat codeert voor het doeleiwit kan worden gefuseerd met het gen dat codeert voor het celwandeiwit van de gist (meestal Aga2p), en het gefuseerde gen kan worden getransformeerd in gistcellen door middel van elektroporatie. Na transformatie kunnen gistcellen die antilichaamgenen op hun oppervlak tot expressie brengen antigeenspecifieke screeningtests ondergaan: de gistbibliotheek wordt geïncubeerd met het doelantigeen en gistcellen die er specifiek aan binden, worden geselecteerd. Met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) om gistcellen te isoleren die eiwitten met de gewenste kenmerken vertonen, kan screening van de gist-display-bibliotheek worden uitgevoerd met een maximale bibliotheekgrootte van ~10^8-10^9 gistcellen. Positieve klonen kunnen vervolgens worden geïsoleerd voor verdere analyse of downstream-toepassingen. Zodra specifieke antilichaamklonen uit de antilichaambibliotheek zijn geïdentificeerd, kunnen ze verder worden gekarakteriseerd en in massa worden geproduceerd, en gezuiverd met behulp van technieken zoals proteïne A/G-affiniteitschromatografie om het volledige proces van gistdisplay-screening en antilichaamproductie te voltooien.

Proces van screening van gistdisplaybibliotheken

Figuur 2 Screeningproces van de gistdisplaybibliotheek

Workflow voor screening van gistbibliotheek

Stappen	Service-inhoud	Tijdlijn
Antigeenbereiding	Antigeentype: Als de klant antigenen kan leveren, moeten de bijbehorende monsters volgens het type worden geleverd: recombinante eiwitten hebben 3-3,5 mg nodig met een zuiverheidsvereiste van meer dan 85%, kleine moleculen moeten worden geconjugeerd met een zuiverheidsvereiste van meer dan 90%, peptidesynthese moet worden geconjugeerd met een zuiverheidsvereiste van meer dan 90%, monstertypen zoals virussen moeten worden geïnactiveerd, RNA moet worden geïnspecteerd om degradatie te voorkomen en de hierboven genoemde antigeentypen kunnen ook worden aangepast voor synthese.	2-3 weken
Dierlijke immuniteit	Het aantal dierlijke vaccinaties is 5 en het is noodzakelijk om te bepalen of het aantal vaccinaties moet worden verhoogd op basis van serumtitertesten. Antigeenimmuniteit: eiwit/virusantigeenpotentie > 105; peptide/kleine molecuulantigeenpotentie > 10^4	5-6 weken
Template cDNA-voorbereiding	Scheid plasma-PBMC's, extraheer totaal RNA (RNA-extractiekit) en converteer dit naar cDNA.	1 dag
Bibliotheekconstructie	Met behulp van bibliotheek-cDNA als template werd het VHH-gen geamplificeerd door twee PCR-rondes en werd een VHH-gensplicing-gistdisplayvector geconstrueerd. De vector werd door middel van elektroporatie in gistcellen getransformeerd om een antilichaambibliotheek te construeren. Selecteer willekeurig 48 klonen en identificeer het positieve percentage (> 90%) met behulp van de PCR-methode; bereken de bibliotheekcapaciteit (10^7-10^8) en gebruik NGS-sequencing om de juiste insertiegraad (> 90%) en diversiteit van de bibliotheek te bepalen.	2 weken
Bibliotheekscreening	Standaard drie screeningsrondes: fluorescentie-gelabelde eiwit-FACS-screening, gevolgd door NGS-sequencing in de derde ronde. Positieve klonen werden geselecteerd op inductie van expressie met één gram en ELISA-detectie. Alle positieve klonen werden geselecteerd voor gensequencing en verschillende CDR-regiosequenties werden geselecteerd.	2-3 weken
Antilichaamverificatie	Het construeren van geschikte expressievectoren voor antilichaamsequenties kan de expressie van antilichamen, de zuivering van antilichamen, ELISA- en BLI-validatie van de antigeenbinding van antilichamen om de affiniteit van antilichamen te verifiëren, en blokkering van flowcytometrie om de celfunctie te valideren, vergemakkelijken.	1 week

Geval van screening van gistoppervlakken in een bibliotheek

In de literatuur over een platform voor de snelle ontdekking van conformationeel selectieve nanobodies op gistoppervlakken, hebben de auteurs een compleet in-vitroplatform voor de ontdekking van nanobodies ontwikkeld, gebaseerd op gistoppervlakken. Eerst werd een synthetische nanobodybibliotheek ontworpen, gebaseerd op kameelgenen. Figuur D laat zien dat het nanobody een HA-tag aan het carboxyluiteinde heeft, waarna het nanobody covalente binding aan de gistcelwand heeft. Figuur E toont het screeningsproces van nanobodies. Gisten met nanobodies met antigeenaffiniteit werden geïsoleerd, geamplificeerd en herhaaldelijk geselecteerd op antilichamen door middel van FACS. De auteurs ontdekten conformationeel selectieve nanobodies die zich via dit platform richten op twee verschillende menselijke GPCR's.