Hva er antistoffteknikk?

Ved hjelp av antistoffteknologi har det vært mulig å modifisere molekylstørrelse, farmakokinetikk, immunogenisitet, bindingsaffinitet, spesifisitet og effektorfunksjon til antistoffer. Etter syntetisering av antistoffer gjør den spesifikke bindingen av antistoffer dem svært verdifulle i klinisk diagnose og behandling. Gjennom antistoffteknologi kan de møte behovene for tidlig legemiddel- og diagnostisk utvikling.

Formålet med antistoffteknologi er å designe og produsere svært spesifikke, stabile funksjoner som naturlige antistoffer ikke kan oppnå, og dermed legge grunnlaget for produksjon av terapeutiske antistoffer.

Alpha Lifetech, med sin omfattende prosjekterfaring innen antistoffteknikk, kan tilby tilpassede monoklonale og polyklonale antistofftjenester for flere arter, samt konstruksjon og screening av fagdisplay-antistoffbiblioteker. Alpha Lifetech kan tilby kunder biosimilar antistoffer og rekombinante proteinprodukter av høy kvalitet, samt tilsvarende tjenester, for å produsere effektive, svært spesifikke og stabile antistoffer. Ved å bruke omfattende antistoff-, proteinplattformer og fagdisplaysystemer, tilbyr vi tjenester som dekker oppstrøms og nedstrøms antistoffproduksjon, inkludert tekniske tjenester som antistoffhumanisering, antistoffrensing, antistoffsekvensering og antistoffvalidering.

Det banebrytende stadiet innen antistoffutvikling er knyttet til to teknologier:

--Rekombinant DNA-teknologi

--Hybridoma-teknologi

Den raske utviklingen av antistoffteknikk er knyttet til tre viktige teknologier:

--Genkloningsteknologi og polymerasekjedereaksjon

--Proteinuttrykk: Rekombinante proteiner produseres av ekspresjonssystemer som gjær, stavformede virus og planter

--Dataassistert strukturdesign

Den første generasjonen antistoffer ble humanisert for produksjon av kimære antistoffer, hvor den variable regionen av musemonoklonale antistoffer ble koblet til den konstante regionen av humane IgG-molekyler. Antigenbindingsregionen (CDR) til andre generasjons musemonoklonale antistoff ble transplantert inn i humant IgG. Med unntak av CDR-regionen er alle andre antistoffer nesten humane antistoffer, og det ble gjort forsøk på å unngå å indusere humane anti-museantistoff (HAMA)-responser når man brukte musekloneantistoffer til behandling av mennesker.

 

For å konstruere et fagdisplaybibliotek er det første trinnet å skaffe genene som koder for antistoffer, som kan isoleres fra B-celler fra immuniserte dyr (konstruksjon av immunbibliotek), ekstraheres direkte fra ikke-immuniserte dyr (konstruksjon av naturlig bibliotek), eller til og med settes sammen in vitro med antistoffgenfragmenter (konstruksjon av syntetisk bibliotek). Deretter amplifiseres genene ved PCR, settes inn i plasmider og uttrykkes i passende vertssystemer (gjærekspresjon (vanligvis Pichia pastoris), prokaryotisk ekspresjon (vanligvis E. coli), pattedyrcelleekspresjon, plantecelleekspresjon og insektcelleekspresjon infisert med stavformede virus). Det vanligste er E. coli-ekspresjonssystemet, som integrerer en spesifikk kodende antistoffsekvens på fagen og koder for et av fagskallproteinene (pIII eller pVIII). Genfusjonen av og vist på overflaten av bakteriofager. Kjernen i denne teknologien er å konstruere et fagdisplaybibliotek, som har fordelen fremfor naturlige biblioteker ved at det kan ha spesifikk binding. Deretter screenes antistoffer med antigenspesifisitet gjennom en biologisk seleksjonsprosess, målantigener fikseres, ubundne fager vaskes bort gjentatte ganger, og bundne fager vaskes bort for ytterligere anrikning. Etter tre eller flere runder med repetisjon isoleres antistoffer med høy spesifisitet og høy affinitet.

Fig. 3: Konstruksjon og screening av antistoffbibliotek

Rekombinant DNA-teknologi kan brukes til å generere antistofffragmenter. Fab-antistoffer kan i utgangspunktet bare hydrolyseres av gastrisk protease for å produsere (Fab')2-fragmenter, som deretter fordøyes av papain for å generere individuelle Fab-fragmenter. Fv-fragmentet består av VH og VL, som har dårlig stabilitet på grunn av fravær av disulfidbindinger. Derfor er VH og VL bundet sammen gjennom et kort peptid på 15–20 aminosyrer for å danne et enkeltkjedet variabelt fragment (scFv)-antistoff med en molekylvekt på omtrent 25 kDa.

Studien av antistoffstrukturen hos kamelfamilien (kamel, liama og alpakka) har belyst at antistoffer bare har tunge kjeder og ingen lette kjeder, derfor kalles de tungkjede-antistoffer (hcAb). Det variable domenet til tungkjede-antistoffer kalles enkeltdomene-antistoffer eller nanobodies eller VHH, med en størrelse på 12–15 kDa. Som monomerer har de ingen disulfidbindinger og er svært stabile, med en svært høy affinitet for antigener.

Fig. 5: Tungkjedeantistoff og VHH/nanostoff

Cellefri ekspresjon benytter ekspresjon av naturlig eller syntetisk DNA for å oppnå in vitro proteinsyntese, vanligvis ved bruk av E. coli-ekspresjonssystemet. Det produserer proteiner raskt og unngår den metabolske og cytotoksiske belastningen på celler når man produserer store mengder rekombinante proteiner in vivo. Det kan også produsere proteiner som er vanskelige å syntetisere, slik som de som er vanskelige å modifisere etter translasjon eller syntetisere membranproteiner.