Technologia prezentacji fagowej polega na wprowadzeniu obcego genu docelowego w określone miejsce białka kapsydu faga i ekspresji obcego genu na powierzchni faga bez zakłócania jego prawidłowego funkcjonowania. Po kilku rundach badań przesiewowych uzyskano ostatecznie białko docelowe o wysokiej specyficzności i aktywności biologicznej.

Technologia ta umożliwia generowanie bibliotek przeciwciał o dużej pojemności. Cykl badań przesiewowych jest krótki, proces operacyjny prosty, a zakres zastosowań szeroki, co pozwala na identyfikację optymalnych sekwencji docelowych peptydów lub białek. W zastosowaniach związanych z wirusami, naukowcy mogą odkrywać przeciwciała wiążące się z krytycznymi epitopami wirusowymi poprzez przeszukiwanie dużych bibliotek przeciwciał. Proces ten może hamować mechanizmy wnikania, replikacji lub unikania odpowiedzi immunologicznej wirusów, tworząc tym samym podstawy do leczenia chorób.

Technologia prezentacji fagowej jest szerzej wykorzystywana niż technologia hybrydoma, która ogranicza się do produkcji niewielkiej ilości przeciwciał przeciwko określonym immunogenom. Natomiast technologia prezentacji fagowej umożliwia prezentację całej biblioteki przeciwciał pochodzących z różnych gatunków układu odpornościowego.

Technologia prezentacji fagowej ma szeroki wachlarz zastosowań, obejmujący m.in. badanie receptorów patogennych mikroorganizmów, badanie interakcji białek, śledzenie transmisji sygnałów między komórkami, diagnostykę chorób zwierząt i opracowywanie szczepionek.

Technologia prezentacji fagowej oferuje liczne korzyści i może być stosowana w różnych dziedzinach. Jednak głównym wyzwaniem w opracowywaniu przeciwciał rekombinowanych z wykorzystaniem tej metody jest złożoność i koszt tego procesu. To podejście wymaga integracji technik biologii molekularnej, w tym mutacji, klonowania i ekspresji, wraz z analizami immunologicznymi, biochemicznymi i biofizycznymi w celu identyfikacji i scharakteryzowania pożądanych przeciwciał.

Prezentacja antygenu jest bardzo ważnym ogniwem. Metody prezentacji antygenu obejmują głównie bezpośrednią prezentację antygenu w powłoce, pośrednią prezentację antygenu w powłoce, prezentację antygenu poprzez badanie całych komórek, prezentację antygenu poprzez liposomy, dyski nanofosfolipidowe i cząsteczki VLP.

Metoda bezpośredniego powlekania jest stosunkowo prosta, ale konformacja antygenu jest łatwa do zmiany, a pośrednia operacja powlekania jest skomplikowana, ale pozwala zachować konformację antygenu i poprawić skuteczność prezentacji. Badania przesiewowe komórek mogą symulować rzeczywiste warunki in vivo, ale istnieje problem niespecyficznego wiązania. Dysk nanofosfolipidowy charakteryzuje się niewielkim rozmiarem, wysoką wydajnością dostarczania i dobrą stabilnością; cząsteczki VLP są połączone z antygenem lub nim owinięte, co zapewnia wysoką immunogenność i bezpieczeństwo, a także może wywołać silną odpowiedź immunologiczną.

Jeśli stężenie jest zbyt niskie, prawdopodobieństwo wiązania się z fagiem spadnie, co przełoży się na niższą skuteczność przesiewu. Z drugiej strony, zbyt wysokie stężenie może zwiększyć prawdopodobieństwo niespecyficznego wiązania, podwyższyć sygnał tła i utrudnić identyfikację klonów dodatnich.

Można zastosować łagodną metodę utrwalania, aby uniknąć wysokich temperatur, silnych kwasów i zasad. Zastosowano metodę pośredniego powlekania oraz układ biotyna-streptawidyna, aby zminimalizować uszkodzenia struktury antygenu. Jeśli antygen jest białkiem błonowym, może być prezentowany na powierzchni nienaruszonych komórek lub użyty do symulacji środowiska błonowego, takiego jak nanodysk, w celu zachowania jego naturalnej konformacji białka błonowego.

Oprócz rutynowych eksperymentów, takich jak ELISA, Western Blotting (WB) i immunofluorescencja (IF), można stosować techniki wykrywania powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) i interferometrii biowarstwowej (BLI) w celu monitorowania procesów wiązania i dysocjacji przeciwciał i antygenów w czasie rzeczywistym, co pozwala na określenie parametrów powinowactwa i kinetyki.

Technologię fagową można wykorzystać do generowania monoklonalnych przeciwciał o wysokim powinowactwie dla szerokiej gamy gatunków wytwarzających przeciwciała, w tym między innymi ludzi, myszy, szczurów, królików, kur, wielbłądów, alpak, krów, psów, owiec, małp i rekinów.

Technologia budowy bibliotek przeciwciał mysich jest dobrze ugruntowana, ekonomiczna i charakteryzuje się krótkim czasem trwania eksperymentów, co czyni ją odpowiednią do wstępnych badań przesiewowych przeciwciał i badań podstawowych. Przeciwciała królicze charakteryzują się silnym powinowactwem i swoistością, a także szerszym zakresem rozpoznawania epitopów w porównaniu z przeciwciałami mysimi. Ludzkie przeciwciała można uzyskać bezpośrednio z bibliotek przeciwciał ludzkich, unikając w ten sposób potencjalnych reakcji immunologicznych, które mogą wystąpić po podaniu przeciwciał heterologicznych do organizmu człowieka. To podejście ma istotne znaczenie w badaniach i rozwoju leków, szczególnie w tworzeniu przeciwciał terapeutycznych.

Immunogeny zwierzęce można ogólnie podzielić na antygen białkowy, antygen polipeptydowy, antygen kwasu nukleinowego i antygen związany z patogenem. Do antygenów związanych z patogenem zalicza się antygen wirusowy (kompletna cząsteczka wirusa, białko wirusa, białko niestrukturalne wirusa itp.), antygen bakteryjny (kompletny ekstrakt bakteryjny, składnik ściany komórkowej, białko wydzielane, toksyna itp.) i antygen pasożytniczy.

Dostosuj immunogeny, zastępując antygeny odpornościowe białkami rekombinowanymi i zastępując cząsteczki wirusa o właściwościach gaśniczych białkami strukturalnymi wirusów. Dostosuj projekt eksperymentu i zmodyfikuj dawkę immunogenu.

Immunogenność można zwiększyć poprzez sprzęganie antygenów z białkami nośnikowymi, takimi jak albumina surowicy bydlęcej. Dodatkowo, adiuwanty immunologiczne, w tym adiuwant Freunda i adiuwant aluminiowy, mogą być stosowane w celu wydłużenia czasu przebywania w organizmie in vivo oraz stymulacji aktywacji i proliferacji komórek układu odpornościowego, zwiększając w ten sposób immunogenność.

Biblioteka przeciwciał fagowych to zbiór różnorodnych przeciwciał fagowych utworzony poprzez zmontowanie kompletnego zestawu genów regionów zmiennych z przeciwciał w wektorach fagowych i ich ekspresję na powierzchni fagów. Proces ten prowadzi do powstania biblioteki przeciwciał fagowych.

Ogólny proces prezentacji fagowej obejmuje kilka kluczowych etapów: ekstrakcję jednojądrowych komórek krwi obwodowej (PBMC) od immunizowanych zwierząt, izolację całkowitego RNA i transkrypcję go do komplementarnego DNA (cDNA), amplifikację genu docelowego za pomocą technologii łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR), klonowanie genu docelowego do wektora fagowego oraz transformację wektora do komórki gospodarza w celu ekspresji. Proces ten prowadzi do skonstruowania biblioteki prezentacji fagowej, która umożliwia szybką identyfikację przeciwciał o wysokim powinowactwie. Biblioteka ta może następnie służyć jako cenne źródło informacji do opracowywania szczepionek, leków terapeutycznych i odczynników diagnostycznych.

W zależności od źródła pochodzenia biblioteki przeciwciał, biblioteki przeciwciał fagowych można podzielić na biblioteki przeciwciał fagowych układu odpornościowego i biblioteki przeciwciał fagowych natywnych. Podstawowa różnica między tymi dwoma typami polega na tym, czy zwierzęta zostały zaszczepione. Ponadto biblioteki przeciwciał natywnych mogą być generowane poprzez półsyntezę lub syntezę.

Istnieją dwa główne wskaźniki oceny jakości biblioteki przeciwciał: pojemność pamięci masowej i różnorodność. Duża pojemność pamięci masowej w połączeniu z dużą różnorodnością zapewnia skuteczne przeszukiwanie przeciwciał o wysokim powinowactwie i swoistości.

W procesie elutriacji biologicznej biblioteka ekspozycyjna jest inkubowana z ustalonymi genami docelowymi, a następnie intensywnie płukana w celu usunięcia niereaktywnych fagów. Koniugaty są zazwyczaj eluowane roztworem kwaśnym lub o wysokiej zawartości soli, a następnie amplifikowane w odpowiednich komórkach gospodarza w celu wzbogacenia. Po 3 do 5 rundach badań przesiewowych uzyskuje się przeciwciała o wysokim powinowactwie.

Metody przesiewowe fagów obejmują przede wszystkim przesiewanie w fazie stałej, przesiewanie w fazie ciekłej oraz przesiewanie na komórkach. Wybór odpowiedniej metody przesiewowej powinien uwzględniać charakterystykę cząsteczek docelowych, cele procesu przesiewowego oraz środowisko laboratoryjne.

Pozytywny screening jest najbardziej podstawową metodą badania przeciwciał fagowych wiążących się z białkami docelowymi. Negatywny screening służy do eliminacji przeciwciał nieswoistych. Podczas badania przeciwciał fagowych, przeciwciała nieswoiste mogą zostać zidentyfikowane w wyniku interferencji ze znacznikiem antygenu docelowego, materiałami lub innymi antygenami o strukturalnym podobieństwie do antygenu docelowego. W takich przypadkach negatywny screening może zwiększyć wydajność procesu przesiewowego.

Metody weryfikacji przeciwciał zazwyczaj obejmują ELISA, Western Blotting (WB), cytometrię przepływową, immunoprecypitację (IP), immunofluorescencję (IF), immunohistochemię i wiele innych technik eksperymentalnych. Alpha Lifetech posiada bogate doświadczenie w wykrywaniu przeciwciał i dysponuje profesjonalnym zespołem eksperymentalnym, co gwarantuje skuteczność przeciwciał w kolejnych eksperymentach.