Czym jest inżynieria przeciwciał?

Dzięki inżynierii przeciwciał możliwe stało się zmodyfikowanie wielkości cząsteczkowej, farmakokinetyki, immunogenności, powinowactwa wiązania, swoistości i funkcji efektorowej przeciwciał. Po syntezie przeciwciał, specyficzne wiązanie przeciwciał sprawia, że ​​są one niezwykle cenne w diagnostyce klinicznej i leczeniu. Dzięki inżynierii przeciwciał mogą one sprostać potrzebom wczesnego rozwoju leków i diagnostyki.

Celem inżynierii przeciwciał jest projektowanie i wytwarzanie wysoce specyficznych, stabilnych funkcji, których naturalne przeciwciała nie są w stanie osiągnąć, co stanowi podstawę do produkcji przeciwciał terapeutycznych.

Alpha Lifetech, dzięki swojemu bogatemu doświadczeniu projektowemu w inżynierii przeciwciał, może świadczyć dostosowane usługi przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych dla wielu gatunków, a także usługi konstrukcji biblioteki przeciwciał eksponowanych przez fagi i przesiewu. Alpha Lifetech może świadczyć klientom wysokiej jakości przeciwciała biopodobne i produkty białkowe rekombinowane, a także odpowiednie usługi, aby produkować wydajne, wysoce specyficzne i stabilne przeciwciała. Wykorzystując kompleksowe platformy przeciwciał, białek i systemów eksponowanych przez fagi, świadczymy usługi obejmujące upstream i downstream produkcji przeciwciał, w tym usługi techniczne, takie jak humanizacja przeciwciał, oczyszczanie przeciwciał, sekwencjonowanie przeciwciał i walidacja przeciwciał.

Pionierski etap inżynierii przeciwciał związany jest z dwiema technologiami:

--Technologia rekombinacji DNA

--Technologia hybrydoma

Szybki rozwój inżynierii przeciwciał wiąże się z trzema ważnymi technologiami:

--Technologia klonowania genów i reakcja łańcuchowa polimerazy

--Ekspresja białek: Białka rekombinowane są produkowane przez systemy ekspresyjne, takie jak drożdże, wirusy w kształcie pręcików i rośliny

--Projektowanie konstrukcyjne wspomagane komputerowo

Pierwszą generację przeciwciał poddano humanizacji w celu produkcji przeciwciał chimerycznych, w których zmienny region mysich przeciwciał monoklonalnych został połączony ze stałym regionem ludzkich cząsteczek IgG. Region wiążący antygen (CDR) mysich przeciwciał monoklonalnych drugiej generacji został przeszczepiony do ludzkiego IgG. Z wyjątkiem regionu CDR, wszystkie inne przeciwciała są niemal ludzkimi przeciwciałami, a podejmowano wysiłki, aby uniknąć wywoływania odpowiedzi ludzkich przeciwciał antymysich (HAMA) podczas stosowania mysich przeciwciał klonowych w leczeniu ludzi.

 

Aby skonstruować bibliotekę ekspozycji fagowej, pierwszym krokiem jest uzyskanie genów kodujących przeciwciała, które można wyizolować z komórek B uodpornionych zwierząt (konstrukcja biblioteki immunologicznej), wyekstrahować bezpośrednio od zwierząt nieuodpornionych (konstrukcja biblioteki naturalnej) lub nawet zmontować in vitro z fragmentami genów przeciwciał (konstrukcja biblioteki syntetycznej). Następnie geny są amplifikowane przez PCR, wprowadzane do plazmidów i wyrażane w odpowiednich układach gospodarza (ekspresja drożdżowa (zwykle Pichia pastoris), ekspresja prokariotyczna (zwykle E. coli), ekspresja w komórkach ssaków, ekspresja w komórkach roślinnych i ekspresja w komórkach owadów zakażonych wirusami w kształcie pręcików). Najczęściej spotykanym jest układ ekspresji E. coli, który integruje specyficzną sekwencję kodującą przeciwciała na fagu i koduje jedno z białek otoczki faga (pIII lub pVIII). Fuzja genów, I wyświetlana na powierzchni bakteriofagów. Sednem tej technologii jest skonstruowanie biblioteki ekspozycji fagowej, która ma przewagę nad bibliotekami naturalnymi, ponieważ może mieć specyficzne wiązanie. Następnie przeciwciała o specyficzności antygenowej są przesiewane poprzez proces selekcji biologicznej, antygeny docelowe są utrwalane, niezwiązane fagi są wielokrotnie wypłukiwane, a związane fagi są wypłukiwane w celu dalszego wzbogacenia. Po trzech lub więcej rundach powtórzeń izolowane są przeciwciała o wysokiej specyficzności i wysokim powinowactwie.

Ryc. 3: Konstrukcja i przesiewanie biblioteki przeciwciał

Technologię rekombinacji DNA można wykorzystać do generowania fragmentów przeciwciał. Przeciwciała Fab mogą być początkowo hydrolizowane jedynie przez proteazę żołądkową w celu wytworzenia fragmentów (Fab ') 2, które są następnie trawione przez papainę w celu wytworzenia pojedynczych fragmentów Fab. Fragment Fv składa się z VH i VL, które mają słabą stabilność z powodu braku wiązań disiarczkowych. Dlatego VH i VL są połączone ze sobą za pomocą krótkiego peptydu składającego się z 15-20 aminokwasów, tworząc przeciwciało o pojedynczym łańcuchu zmiennego fragmentu (scFv) o masie cząsteczkowej wynoszącej około 25 kDa.

Badanie struktury przeciwciał u wielbłądowatych (Camel, LIama i Alpaca) wyjaśniło, że przeciwciała mają tylko łańcuchy ciężkie i nie mają łańcuchów lekkich, stąd nazywane są przeciwciałami łańcuchów ciężkich (hcAb). Domena zmienna przeciwciał łańcuchów ciężkich nazywana jest przeciwciałami jednodomenowymi lub nanociałami lub VHH, o wielkości 12-15 kDa. Jako monomery nie mają wiązań disiarczkowych i są bardzo stabilne, z bardzo wysokim powinowactwem do antygenów.

Ryc. 5: Przeciwciało łańcuchowe ciężkie i VHH/nanociało

Ekspresja bezkomórkowa wykorzystuje ekspresję naturalnego lub syntetycznego DNA w celu osiągnięcia syntezy białek in vitro, zazwyczaj przy użyciu systemu ekspresji E. coli. Produkuje białka szybko i unika obciążenia metabolicznego i cytotoksycznego komórek podczas produkcji dużych ilości białek rekombinowanych in vivo. Może również produkować białka, które są trudne do syntezy, takie jak te, które są trudne do modyfikacji po translacji lub syntezie białek błonowych.