Czym jest inżynieria przeciwciał?

Dzięki inżynierii przeciwciał możliwa stała się modyfikacja wielkości cząsteczek, farmakokinetyki, immunogenności, powinowactwa wiązania, swoistości i funkcji efektorowej przeciwciał. Po syntezie przeciwciał, ich specyficzne wiązanie czyni je niezwykle cennymi w diagnostyce klinicznej i leczeniu. Dzięki inżynierii przeciwciał mogą one sprostać potrzebom wczesnego rozwoju leków i diagnostyki.

Celem inżynierii przeciwciał jest projektowanie i wytwarzanie wysoce specyficznych, stabilnych funkcji, których naturalne przeciwciała nie są w stanie osiągnąć, co stanowi podstawę do produkcji przeciwciał terapeutycznych.

Firma Alpha Lifetech, dzięki bogatemu doświadczeniu w projektach inżynierii przeciwciał, oferuje spersonalizowane usługi w zakresie przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych dla wielu gatunków, a także budowę bibliotek przeciwciał z ekspozycją fagową i usługi screeningu. Alpha Lifetech może dostarczyć klientom wysokiej jakości przeciwciała biopodobne i rekombinowane produkty białkowe, a także powiązane usługi, umożliwiające produkcję wydajnych, wysoce specyficznych i stabilnych przeciwciał. Wykorzystując kompleksowe platformy przeciwciałowe, białkowe i systemy ekspozycji fagowej, oferujemy usługi obejmujące zarówno wstępny, jak i końcowy etap produkcji przeciwciał, w tym usługi techniczne, takie jak humanizacja przeciwciał, oczyszczanie przeciwciał, sekwencjonowanie przeciwciał i walidacja przeciwciał.

Pionierski etap inżynierii przeciwciał wiąże się z dwiema technologiami:

--Technologia rekombinacji DNA

--Technologia hybrydoma

Szybki rozwój inżynierii przeciwciał wiąże się z trzema ważnymi technologiami:

--Technologia klonowania genów i reakcja łańcuchowa polimerazy

--Ekspresja białek: Białka rekombinowane są produkowane przez systemy ekspresyjne, takie jak drożdże, wirusy pręcikowate i rośliny

--Projektowanie konstrukcyjne wspomagane komputerowo

Pierwszą generację przeciwciał zhumanizowano do produkcji przeciwciał chimerycznych, w których region zmienny mysich przeciwciał monoklonalnych został połączony z regionem stałym ludzkich cząsteczek IgG. Region wiążący antygen (CDR) mysich przeciwciał monoklonalnych drugiej generacji został przeszczepiony do ludzkiej IgG. Z wyjątkiem regionu CDR, wszystkie pozostałe przeciwciała są niemalże przeciwciałami ludzkimi, a dołożono starań, aby uniknąć indukowania odpowiedzi ludzkich przeciwciał antymysich (HAMA) podczas stosowania mysich przeciwciał klonowanych w leczeniu ludzi.

 

Aby skonstruować bibliotekę prezentacji fagowej, pierwszym krokiem jest uzyskanie genów kodujących przeciwciała, które mogą być izolowane z limfocytów B immunizowanych zwierząt (konstrukcja biblioteki immunologicznej), ekstrahowane bezpośrednio od nieimmunizowanych zwierząt (konstrukcja biblioteki naturalnej) lub nawet montowane in vitro z fragmentami genów przeciwciał (konstrukcja biblioteki syntetycznej). Następnie geny są amplifikowane przez PCR, wprowadzane do plazmidów i wyrażane w odpowiednich systemach gospodarza (ekspresja drożdżowa (zwykle Pichia pastoris), ekspresja prokariotyczna (zwykle E. coli), ekspresja w komórkach ssaków, ekspresja w komórkach roślinnych i ekspresja w komórkach owadzich zakażonych wirusami o kształcie pręcików). Najbardziej powszechnym jest system ekspresji E. coli, który integruje specyficzną sekwencję kodującą przeciwciała na fagu i koduje jedno z białek otoczki faga (pIII lub pVIII). Fuzja genów, A prezentowane na powierzchni bakteriofagów. Sednem tej technologii jest skonstruowanie biblioteki prezentacji fagowej, która ma przewagę nad bibliotekami naturalnymi, ponieważ może mieć specyficzne wiązanie. Następnie przeciwciała o swoistości antygenowej są przesiewane w procesie selekcji biologicznej, antygeny docelowe są utrwalane, niezwiązane fagi są wielokrotnie wypłukiwane, a związane fagi są wypłukiwane w celu dalszego wzbogacenia. Po trzech lub więcej rundach powtarzania, izolowane są przeciwciała o wysokiej swoistości i wysokim powinowactwie.

Ryc. 3: Konstrukcja i przesiewanie biblioteki przeciwciał

Technologia rekombinacji DNA może być wykorzystana do generowania fragmentów przeciwciał. Przeciwciała Fab mogą być początkowo hydrolizowane jedynie przez proteazę żołądkową, tworząc fragmenty (Fab')2, które następnie są trawione przez papainę, tworząc pojedyncze fragmenty Fab. Fragment Fv składa się z VH i VL, które charakteryzują się niską stabilnością ze względu na brak wiązań disiarczkowych. Dlatego też VH i VL są połączone krótkim peptydem o długości 15-20 aminokwasów, tworząc przeciwciało o pojedynczym łańcuchu zmiennym (scFv) o masie cząsteczkowej około 25 kDa.

Badania struktury przeciwciał u wielbłądowatych (wielbłąd, liama i alpaka) wykazały, że przeciwciała posiadają jedynie łańcuchy ciężkie, a nie posiadają łańcuchów lekkich, stąd nazywane są przeciwciałami łańcuchów ciężkich (hcAb). Domena zmienna przeciwciał łańcuchów ciężkich nazywana jest przeciwciałami jednodomenowymi lub nanociałami (VHH), o masie cząsteczkowej 12–15 kDa. Jako monomery, nie posiadają wiązań disiarczkowych i są bardzo stabilne, wykazując bardzo wysokie powinowactwo do antygenów.

Ryc. 5: Przeciwciało łańcuchowe ciężkie i VHH/nanociało

Ekspresja bezkomórkowa wykorzystuje ekspresję naturalnego lub syntetycznego DNA do syntezy białek in vitro, zazwyczaj z wykorzystaniem systemu ekspresji E. coli. Pozwala ona na szybką produkcję białek i unika obciążenia metabolicznego i cytotoksycznego komórek podczas produkcji dużych ilości białek rekombinowanych in vivo. Może również produkować białka trudne do syntezy, takie jak białka trudne do modyfikacji po translacji lub syntezy białek błonowych.