Usługa budowy biblioteki prezentacji fagowej

Alpha Lifetech od wielu lat intensywnie angażuje się w technologię prezentacji fagowej. Stworzyła doskonałą, stabilną platformę technologii prezentacji fagowej, która oszczędza czas badań naukowych i projektowych, a także ułatwia późniejszą produkcję. Alpha Lifetech oferuje również klientom usługi takie jak produkcja przeciwciał vhh, scFv i Fab.

Alpha Lifetech dysponuje kompleksową platformą do prezentacji fagowej M13/T7, która umożliwia budowę i produkcję bibliotek przeciwciał. Oferujemy również usługi dostosowane do Państwa potrzeb, takie jak produkcja przeciwciał scFv i wysokoprzepustowe badania przesiewowe przeciwciał.

Wprowadzenie do prezentacji fagowej

Technologia prezentacji fagowej to technika wykorzystująca fagi (wirusy infekujące bakterie) do poszukiwania funkcjonalnych cząsteczek wiążących specyficzne białka lub peptydy. Techniki konstrukcji bibliotek przeciwciał fagowych obejmują budowę bibliotek przeciwciał Fab, budowę bibliotek przeciwciał scFv, budowę bibliotek nanociał itp. W zależności od rodzaju bakteriofagi można podzielić na systemy M13, T7, T4, λ i inne. Ze względu na rodzaj biblioteki można ją podzielić na biblioteki losowych peptydów, biblioteki cDNA, biblioteki przeciwciał i biblioteki białek. Technologia prezentacji fagowej jest prosta w obsłudze i tania w użyciu. Jednak technika ta ogranicza różnorodność genetyki molekularnej w bibliotece, która nie może ekspresjonować zbyt długich sekwencji.

Obecnie technologia ekspozycji fagowej jest szeroko stosowana. Wśród nich znajdują się znaczące osiągnięcia w badaniach i rozwoju nowych szczepionek (tanie i skuteczne szczepionki syntetyczne), rozwoju leków przeciwciałowych (badania przesiewowe inhibitorów enzymów), transdukcji sygnału komórkowego (badania symulowanych epitopów) oraz badaniach epitopów antygenowych (przygotowywanie przeciwciał monoklonalnych).

Wprowadzenie do bakteriofaga T7

Bakteriofag T7 składa się z dwuniciowego DNA o długości 40 kb, owiniętego kapsydem o średnicy 60 nm. Łącznikiem między głową a ogonem jest struktura pierścieniowa złożona z wielu kopii gp8. Głowa i rdzeń bakteriofaga T7 tworzą strukturę cylindryczną, która wiąże się z gp8 i może łączyć głowę z ogonem.

Rys. 1 Schematyczne przedstawienie bakteriofaga T7.(Odniesienie: Postępy w systemie prezentacji fagowej T7 (przegląd))

Wprowadzenie do bakteriofaga M13

Bakteriofag M13 należy do grupy fagów nitkowatych, zbiorczo zwanych fagami Ff. Ma długość 900 nm i szerokość 6,5 nm. Zawiera genom jednoniciowego DNA (ssDNA) o długości 6407 pz, który składa się z dziewięciu genów kodujących 11 różnych białek. Pięć z nich to białka otoczki, a sześć z nich bierze udział w replikacji i montażu faga. Największe stężenie białek otoczki występuje w białku kapsydu G8P, które składa się z około 2700 jednostek białkowych i tworzy otoczkę wokół chromosomu.

Rys. 2 Schematyczne przedstawienie bakteriofaga M13.(Odniesienie: Podstawy technologii prezentacji przeciwciał fagowych)

Wprowadzenie do biblioteki przeciwciał prezentujących fagi

Odkrywanie przeciwciał zyskuje coraz większe znaczenie we współczesnej medycynie. Istnieją różne metody odkrywania przeciwciał, ale biblioteka przeciwciał eksponowanych na fagach jest częściej wykorzystywana w naukach medycznych.

Od 1990 roku do konstruowania bibliotek fagowych stosowano różne formaty przeciwciał, w tym VH, VHH, scFv, diaciała i przeciwciała Fab. ScFv, składające się z domen strukturalnych VH i VL, to jednołańcuchowe przeciwciała wykorzystywane do konstruowania bibliotek przeciwciał scFv. scFv charakteryzuje się krótkim okresem półtrwania i niską immunogennością. Biblioteka przeciwciał Fab składa się z VH, VL, CL i CH1, które umożliwiają szybkie wyszukiwanie idealnych przeciwciał o wysokim powinowactwie. Najmniejsza jednostka, która może wiązać docelowy antygen – VHH – stanowi obecnie bibliotekę nanociał. VHH charakteryzuje się prostą strukturą, małą objętością, wysoką rozpuszczalnością, dobrą stabilnością oraz łatwością przygotowania i ekspresji. Biblioteki syntetycznych nanociał (Nb) stają się atrakcyjną alternatywą dla immunizacji zwierząt, zapewniając stabilne, syntetyczne nanociała o wysokim powinowactwie. Ogólnie rzecz biorąc, te fragmenty przeciwciał są łączone z G3P faga M13, a klonując dużą liczbę genów kodujących fragment przeciwciała, można wygenerować duże biblioteki przeciwciał eksponowanych na fagach, z których można wybrać wiele różnych przeciwciał.

Proces konstrukcji biblioteki fagowej

Proces konstrukcji biblioteki fagowej przebiega następująco: projektuje się specyficzne startery do amplifikacji PCR, która pozwala na uzyskanie produktów, które są enzymatycznie ligowane z wektorem fagowym T7/M13, a następnie z powodzeniem konstruuje się rekombinowany plazmid fagowy. Rekombinowany plazmid fagowy transformowano do komórek receptorowych TG1, a następnie opłaszczano nim pożywkę zawierającą odpowiednie antybiotyki, a po przesianiu transformatorów przeprowadzano hodowlę ekspandowaną. Po wielu rundach hodowli fag replikuje się w bakteriach i z powodzeniem ekspresjonuje docelowe białko lub polipeptyd. Następnie biblioteka fagowa jest oczyszczana w celu usunięcia zanieczyszczeń i niezwiązanych fagów.

Regiony zmienne (VH i VL) korelowały z różnorodnością przeciwciał, a VH i VL zostały wprowadzone do wektora fagowego wraz z sekwencją kodującą białko fagowe PIII. Po złożeniu, cząstka faga jest eksponowana i łączona z N-końcowym odcinkiem mniejszego białka otoczki III, tworząc funkcjonalny fragment przeciwciała, uzyskując bibliotekę zawierającą sekwencję DNA przeciwciała.

Po zakończeniu immunizacji oznaczano miano, a po jego ustaleniu pobierano krew od zwierzęcia. Z krwi izolowano limfocyty, ekstrahowano RNA, amplifikowano fragment docelowy metodą RT-PCR i uzyskiwano fragment genu regionu V. Gen V amplifikowano za pomocą specyficznego primera.

Utworzone biblioteki naturalne obejmują słabo immunogenne przeciwciała u zwierząt, które mogą atakować dowolny cel. Przeciwciała fagowe, które wiążą się specyficznie z antygenem, można zebrać za pomocą technik przesiewowych, które utrwalają lub znakują antygen.

Docelowy antygen jest utrwalany na stałym nośniku, takim jak otwór mikropłytki, lub sprzężony z kulką magnetyczną. Następnie dodaje się bibliotekę przeciwciał fagowych w celu związania jej z antygenem. Po wielokrotnych elucjach fagi o niskim powinowactwie lub niespecyficzne są wypłukiwane, a te, które wykazują specyficzne przeciwciała, pozostają.

Zastosowanie prezentacji fagowej

*Odkrywanie przeciwciał zyskuje coraz większe znaczenie we współczesnej medycynie. Istnieją różne metody odkrywania przeciwciał, ale technologia prezentacji fagowej jest częściej wykorzystywana w naukach medycznych. Od 1990 roku do konstruowania bibliotek fagowych stosowano różne formaty przeciwciał, w tym przeciwciała VH, VHH, scFv, diaciała i przeciwciała Fab.
*Biblioteki peptydów fagowych umożliwiają szybkie określenie sekwencji epitopów białkowych i stały się potężnym narzędziem do badania interakcji pomiędzy epitopami i receptorami antygenów
*Fragmenty przeciwciał są łączone z G3P faga M13, a klonując dużą liczbę genów kodujących fragment przeciwciała, można wygenerować duże biblioteki przeciwciał eksponowanych na fagach, z których można wybrać wiele różnych przeciwciał.
*System prezentacji fagowej T7 ma wiele zalet, do których należą prostota, wysokie bezpieczeństwo, stabilność, łatwość przechowywania i transportu, dzięki czemu jest stosowany w szczepionkach profilaktycznych i terapeutycznych.
*System prezentacji fagowej T7 umożliwia wykrywanie różnych antygenów, takich jak antygeny powierzchniowe patogennych mikroorganizmów i antygeny nowotworowe.

Fag