Usługa przesiewowa biblioteki powierzchni drożdży

Alpha Lifetech specjalizuje się w budowie bibliotek drożdżowych i przesiewie bibliotek przeciwciał, oferując klientom na całym świecie możliwość generowania różnych form bibliotek drożdżowych i przeszukiwania ich pod kątem przeciwciał o wysokim powinowactwie i swoistości. Dzięki zespołowi doświadczonych badaczy, zaawansowanej technologii i sprzętowi, możemy budować biblioteki drożdżowe ukierunkowane na szeroką gamę białek związanych z chorobami. Oferujemy technologie prezentacji fagowej i drożdżowej, w tym prezentację białek drożdżowych, prezentację małych cząsteczek drożdżowych, prezentację przeciwciał drożdżowych itp.

Nasze biblioteki drożdżowe charakteryzują się dużą pojemnością i wysoką różnorodnością, co stanowi solidną podstawę do skutecznego przeszukiwania specyficznych sekwencji przeciwciał. Możemy konstruować różne formy bibliotek drożdżowych z przeciwciałami (IgG, scFv, VHH, Fab), biblioteki białek, biblioteki peptydów, biblioteki cDNA itp., zgodnie z Państwa potrzebami. Ponadto, możemy również tworzyć biblioteki przeciwciał o różnych właściwościach, w tym biblioteki immunologiczne, biblioteki naturalne, biblioteki syntetyczne, biblioteki półsyntetyczne oraz biblioteki przeciwciał przeciw chorobom.

Wprowadzenie do systemu ekspozycji drożdży

Technologia prezentacji powierzchniowej drożdży to metoda prezentacji rekombinowanych białek na powierzchni drożdży poprzez fuzję genów. Najpopularniejszy system prezentacji drożdży wykorzystuje białko docelowe połączone z C-końcową podjednostką Aga2p białka parującego alfa-lektyny, składającego się głównie ze znaczników epitopowych po obu stronach białka docelowego: N-końcowego znacznika hemaglutyniny (HA) złożonego z 9 aminokwasów i C-końcowego znacznika c-myc złożonego z 10 aminokwasów. Podjednostka Aga2p, złożona z 69 aminokwasów, wiąże się z podjednostką Aga1p, złożoną z 725 aminokwasów alfa-lektyny, poprzez dwa wiązania disiarczkowe, a Aga1p jest zakotwiczona w ścianie komórkowej poprzez kowalencyjne wiązanie β-1,6-glukanu. W ten sposób białko docelowe jest prezentowane na powierzchni komórek drożdży, a następnie rozpoznawane przez odpowiedni ligand. Oddzielenie funkcjonalnych białek od bibliotek poprzez przesiewowe badania cytometryczne.

Rys. 1: Zasada prezentacji obrazu na powierzchni drożdży. (Źródło rysunku: Zastosowanie wyświetlaczy powierzchniowych drożdży w inżynierii białek.)

Wprowadzenie do biblioteki wyświetlaczy powierzchni drożdży

Sortowanie drożdżowe opiera się na prezentacji powierzchniowej drożdży i jest wykorzystywane głównie do przeszukiwania bibliotek przeciwciał ukierunkowanych na białka powierzchniowe komórek. Ze względu na niskie niespecyficzne wiązanie między komórkami drożdży a powierzchniami innych komórek, selekcja biologiczna drożdży umożliwia przeszukiwanie dużych bibliotek wiążących w celu znalezienia rzadkich klonów.

Usługa przesiewowa biblioteki powierzchni drożdży

Przygotuj plazmidy i wyhoduj komórki drożdżowe, zsyntetyzuj DNA kodujące białko docelowe i sklonuj je do wektora ekspresyjnego drożdży zawierającego indukowalne promotory, peptydy sygnałowe i geny docelowe połączone z białkami ekspozycyjnymi na powierzchni (takimi jak Aga2p). Gen kodujący białko docelowe można połączyć z genem kodującym białko ściany komórkowej drożdży (zwykle Aga2p), a następnie połączony gen można transformować do komórek drożdży poprzez elektroporację. Po transformacji komórki drożdży ekspresjonujące geny przeciwciał na powierzchni mogą zostać poddane testom przesiewowym specyficznym dla antygenu: biblioteka drożdżowa jest inkubowana z antygenem docelowym, a komórki drożdży, które specyficznie się z nim wiążą, są wybierane. Wykorzystując sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) do izolacji komórek drożdży prezentujących białka o pożądanych właściwościach, można przeprowadzić przesiew biblioteki ekspozycyjnej drożdży o maksymalnej wielkości biblioteki ~10^8-10^9 komórek drożdży. Pozytywne klony można następnie wyizolować do dalszej analizy lub dalszych zastosowań. Po zidentyfikowaniu specyficznych klonów przeciwciał w bibliotece przeciwciał można je poddać dalszej charakterystyce, rozpocząć masową produkcję i oczyścić przy użyciu takich technik, jak chromatografia powinowactwa do białek A/G, co pozwala na zakończenie całego procesu badania ekspresji genów drożdży i produkcji przeciwciał.

Proces przesiewania biblioteki ekspozycyjnej drożdży

Rys.2 Proces przesiewania biblioteki ekspozycyjnej drożdży

Przebieg pracy usługi przesiewowej biblioteki ekspozycyjnej drożdży

Kroki	Treść usługi	Oś czasu
Przygotowanie antygenu	Typ antygenu: Jeśli klient może dostarczyć antygeny, należy dostarczyć odpowiednie próbki zgodnie z typem: białka rekombinowane wymagają 3-3,5 mg przy wymogu czystości ponad 85%, małe cząsteczki należy sprzężyć przy wymogu czystości ponad 90%, synteza peptydów musi być sprzężona przy wymogu czystości ponad 90%, typy próbek, takie jak wirusy, muszą zostać inaktywowane, RNA należy sprawdzić, aby zapobiec degradacji, a powyższe typy antygenów można również dostosować do syntezy.	2-3 tygodnie
Odporność zwierząt	Liczba szczepień zwierząt wynosi 5 i konieczne jest określenie, czy należy zwiększyć liczbę szczepień na podstawie badania miana przeciwciał w surowicy. Odporność antygenowa: potencjał antygenu białkowego/wirusowego >105; potencjał antygenu peptydowego/małocząsteczkowego >104	5-6 tygodni
Przygotowanie matrycy cDNA	Oddziel osocze PBMC, wyekstrahuj całkowite RNA (zestaw do ekstrakcji RNA) i odwróć do cDNA.	1 dzień
Budowa biblioteki	Używając cDNA biblioteki jako matrycy, gen VHH amplifikowano w dwóch rundach PCR, a następnie skonstruowano drożdżowy wektor ekspozycyjny do składania genu VHH. Wektor wprowadzono do komórek drożdży metodą elektroporacji, aby zbudować bibliotekę przeciwciał. Wybrano losowo 48 klonów i określono odsetek dodatnich (>90%) za pomocą metody PCR; obliczono pojemność biblioteki (107-108), sekwencjonowano metodą NGS w celu określenia prawidłowego odsetka insercji w bibliotece (>90%) i jej różnorodności.	2 tygodnie
Badania biblioteczne	Domyślnie trzy rundy przesiewowe: przesiewowe FACS białka znakowanego fluorescencyjnie, a następnie sekwencjonowanie NGS w trzeciej rundzie. Pozytywne klony wybrano do indukcji ekspresji pojedynczego grama i detekcji w teście ELISA. Wszystkie pozytywne klony wybrano do sekwencjonowania genów i różnych sekwencji regionów CDR.	2-3 tygodnie
Weryfikacja przeciwciał	Konstrukcja odpowiednich wektorów ekspresji dla sekwencji przeciwciał może ułatwić ekspresję przeciwciał, oczyszczanie przeciwciał, walidację wiązania antygenu przeciwciała za pomocą testów ELISA i BLI w celu sprawdzenia powinowactwa przeciwciała oraz blokadę cytometrii przepływowej w celu potwierdzenia funkcji komórki.	1 tydzień

Przypadek badania biblioteki powierzchniowej drożdży

W literaturze poświęconej platformie prezentacji na powierzchni drożdży, służącej do szybkiego odkrywania konformacyjnie selektywnych nanociał, autorzy opracowali kompletną platformę do odkrywania nanociał in vitro opartą na prezentacji na powierzchni drożdży. Najpierw zaprojektowano syntetyczną bibliotekę nanociał, bazując na genach wielbłąda. Rysunek D przedstawia, że nanociało ma znacznik HA na końcu karboksylowym, a następnie jest kowalencyjnie wiązane ze ścianą komórkową drożdży. Rysunek E przedstawia proces przesiewu nanociał. Drożdżowe nanociała o powinowactwie do antygenu zostały wyizolowane, amplifikowane i wielokrotnie selekcjonowane pod kątem przeciwciał metodą FACS. Autorzy odkryli za pomocą tej platformy konformacyjnie selektywne nanociała ukierunkowane na dwa różne ludzkie receptory GPCR.