Plataforma de Imunização Animal

As fontes animais da Alpha Lifetech são transparentes, com licenças de inspeção e quarentena, histórico genético claro, frequência de imunização definida e registros detalhados dos intervalos de imunização, proporcionando serviços convenientes para a produção de anticorpos. A empresa imuniza principalmente animais da família Camelidae (alpacas e camelos), estabelecendo as bases para a produção de nanocorpos. Além disso, também pode imunizar animais comuns (como coelhos brancos da Nova Zelândia, camundongos e outros) de acordo com a frequência de imunização e os requisitos de imunogenicidade exigidos pelos clientes, extrair e isolar os imunógenos em PBMCs e utilizá-los em experimentos subsequentes (como o desenvolvimento de anticorpos monoclonais e policlonais, etc.). Os clientes podem fornecer seus próprios imunógenos, e nós realizaremos um rigoroso controle de qualidade. Caso os clientes forneçam imunógenos virais, estes precisam ser inativados, e realizaremos testes de inativação para garantir a segurança. Ao mesmo tempo, também podemos personalizar imunógenos de acordo com as necessidades do cliente.

Introdução à Imunização Animal

Na produção de anticorpos derivados de animais, como anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e nanocorpos, o primeiro passo é imunizar os animais e obter as células B, anticorpos ou PBMCs correspondentes para preparar a produção de anticorpos, promover a pesquisa científica básica, desenvolver ferramentas de diagnóstico clínico e facilitar a descoberta e o desenvolvimento de novos medicamentos. Camelídeos, alpacas, liamas e outros camelídeos da família Camelidae podem produzir bibliotecas de nanocorpos (anticorpos de domínio único) por meio da coleta de sangue imunizado e extração de PBMCs. Coelhos e outros animais podem ser imunizados e os anticorpos podem ser extraídos de seus corpos. Após a purificação, podem ser usados para produzir anticorpos policlonais. Camundongos, ratos, etc., podem ser usados para produzir anticorpos monoclonais pela fusão de células B extraídas do sistema imune com células de mieloma. Antes da imunização, deve-se atentar para os princípios dos 3Rs (substituição, redução e refinamento), que podem reduzir significativamente o número de animais utilizados ao mínimo necessário, aprimorar os procedimentos experimentais e minimizar o sofrimento animal. É imprescindível seguir um planejamento experimental adequado, a seleção de anticorpos apropriados e procedimentos de validação rigorosos.

Classificação de imunógenos - produção de nanocorpos

Tipos de imunógenos	Exemplo	Preparação de imunógeno	Notas
Imunógenos proteicos	Enzimas, proteínas, toxinas bacterianas e outras substâncias.	Escolha diferentes sistemas de expressão de proteínas: E. coli, levedura, células de inseto, células de mamífero e sistema acelular.	Preste atenção a fatores como temperatura, tempo, pH e corpos de inclusão que afetam a expressão proteica.
Imunógenos de Ácidos Nucleicos	DNA, RNA	Imunógeno de DNA: Construir DNA plasmídico, clonar vetores de expressão adequados para os genes-alvo, cultivar células para amplificar o DNA plasmídico e extrair DNA plasmídico de alta pureza. Imunógeno de RNA: Necessidade de adicionar estrutura de chapéu e cauda poli-A para evitar a degradação.	Ao preparar imunógenos de DNA, deve-se atentar para as células hospedeiras apropriadas, e ao preparar imunógenos de RNA, deve-se atentar para a prevenção da degradação do RNA.
Imunógenos Virais	Vacina de vírus inteiro inativado, vacina de subunidade, vacina de vetor viral (adenovírus, lentivírus, etc.), vacina de mRNA.	Na preparação de uma vacina de vírus inteiro inativado, o vírus é primeiro inativado para aumentar a segurança. Testes de toxicidade são usados para determinar se a inativação foi completa. Vacinas de subunidades requerem apenas proteínas da superfície viral como antígenos e precisam considerar a eficácia imunológica.	É necessário adicionar adjuvantes para proporcionar efeitos imunológicos, deve-se atentar para o vírus que precisa ser inativado, títulos virais adequados são necessários para garantir os efeitos imunológicos e a segurança do processo de preparação deve ser rigorosamente controlada.

Processo ou Cronograma de Imunização Animal

Seleção de animais e preparação de antígenos

Seleção de animais: Selecione alpacas com a idade adequada e constituição física saudável, provenientes de grupos saudáveis, e realize exames de sangue e triagem de doenças para garantir que não haja doenças infecciosas ou outros problemas de saúde.

Preparação do imunógeno: Os imunógenos são essenciais para induzir respostas imunes e requerem a seleção de proteínas, peptídeos ou outras substâncias apropriadas, com base nos requisitos do anticorpo alvo.

Uma alpaca pode ser imunizada com 1 a 3 antígenos simultaneamente, com uma quantidade total de antígeno de 1 a 2 mg por imunização e um volume inferior a 2 mL. Antes da imunização, o antígeno e o adjuvante são emulsionados na proporção de 1:1 para formar uma mistura homogênea, que é armazenada a 4 °C.

Alpaca imunológica

Anote o número da orelha da alpaca e inicie o experimento de imunização. Injete nos linfonodos próximos ao pescoço da alpaca em ambos os lados, com 2 pontos de cada lado, injetando aproximadamente 0,4 mL de antígeno emulsionado em cada ponto. Após a imunização, observe por meia hora para confirmar que a alpaca não apresenta sintomas de desconforto. A imunização deve ser administrada a cada 2 semanas, com pelo menos 4 doses.

Coleta de sangue

Após 4 imunizações, realizadas em um intervalo de 5 a 7 dias, colete 50 ml de sangue da veia do pescoço da alpaca.

Separação de soro

Amostras de sangue são coletadas para avaliação imunológica antes de cada imunização com antígeno, sendo retirados 5 mL de sangue a cada coleta. No mesmo dia, o sangue foi centrifugado a 400 xg por 30 minutos em uma centrífuga pré-resfriada a 25 °C. A camada superior de soro foi separada e armazenada para posterior teste de titulação de anticorpos.

Linfócitos separados

Primeiro, adicione 15 mL de solução de separação celular e, em seguida, adicione lentamente 15 mL de sangue a um tubo de centrífuga de 50 mL. Adicione o sangue com cuidado e lentamente para evitar a mistura com a solução de separação. Centrifugue previamente resfriado a 25 °C a 400 xg por 30 minutos e transfira o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga a -80 °C. Utilize uma pipeta para aspirar a camada intermediária de células imunes, com formato semelhante a algodão, para um novo tubo de centrífuga de 50 mL. Adicione 10 mL de tampão PBS à temperatura ambiente a cada tubo e centrifugue a 25 °C e 400 xg por 20 minutos. Remova o sobrenadante, adicione 5 mL de tampão PBS à temperatura ambiente a cada tubo, misture bem e conte as células utilizando uma câmara de Neubauer. Em seguida, centrifugue a 25 °C e 400 xg por 20 minutos. Remova o sobrenadante e dissolva os linfócitos obtidos por RNAiso Plus com base no número de células para obter um lisado celular de 10 ^ 7/mL, que deve ser armazenado a -80 ℃.

Figura 1: Representação esquemática de diferentes estratégias de descoberta de anticorpos e das etapas experimentais envolvidas. (Fonte da figura: Laustsen, Andreas H. e outros.)

Os clientes fornecem imunógenos - controle de qualidade rigoroso

Tipos de imunógenos	Exigência	Método de Controle de Qualidade
Amostras de peptídeos/pequenas moléculas	Condições de dissolução (dependendo principalmente da capacidade de inativar os fagos), estrutura molecular/sequência peptídica, relatório de síntese (HPLC/MS/HNMR)	Detecção por HPLC/MS
Amostras de Proteína	SDS-PAGE/WB, condições de reconstituição, tampão, informações do rótulo, quantidade total (20-50 µg), concentração, pureza, etc.	SDS-PAGE/WB
Amostras de células	Tipo celular (células primárias/células geneticamente modificadas), forma celular (fresca/congelada e descongelada), tipo de crescimento (aderente/em suspensão), requisitos do meio de cultura, número de células fornecidas, células geneticamente modificadas para garantir a expressão estável dos alvos de triagem (anticorpo primário correspondente ao cliente), células congeladas e descongeladas para determinar a taxa de recuperação.	O foco principal são células geneticamente modificadas, utilizando anticorpos primários fornecidos pelo cliente para identificação da expressão do alvo por ELISA (nossa empresa fornece anticorpos secundários HRP) e detecção por citometria de fluxo (nossa empresa pode fornecer anticorpos secundários fluorescentes).

Quais são as aplicações da imunidade animal?

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Os anticorpos policlonais podem ser produzidos pela imunização de animais, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos pela fusão de células B com células de mieloma, e as PBMCs podem ser extraídas de fontes camelíferas (alpaca, camelo, etc.) para produzir várias formas de fragmentos de anticorpos, como nanocorpos, fragmentos Fab, fragmentos de anticorpos scFv, etc.
Quais são as precauções para a imunidade animal?

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Para produzir nanoanticorpos para animais derivados de camelos, são necessárias de 5 a 6 imunizações. Amostras de sangue devem ser coletadas como controle antes da imunização, com um intervalo de 2 semanas entre cada imunização. Após a quarta imunização, amostras de sangue positivas e amostras de sangue negativas de animais não imunizados devem ser coletadas para ELISA, a fim de determinar o título. Se o título for inferior a 10^6, o número de imunizações deve ser aumentado até que o título atinja um nível adequado. Para outras imunizações animais, como a imunização de coelhos (o nível ideal ou comum de antígeno proteico para imunização de coelhos é de 50 a 1000 µg), a imunização de camundongos (o nível ideal ou comum de antígeno proteico para imunização de camundongos é de 5 a 50 µg, o que requer 10^6 células se for uma célula, e 10 a 50 µg para ácido nucleico ou carboidratos), a imunização de cabras (o nível ideal ou comum de antígeno proteico para imunização de cabras é de 250 a 5000 µg), etc., deve-se atentar para a dosagem, segurança e eficácia dos imunógenos.
Como escolher animais imunes?

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Dependendo do tipo de anticorpo necessário, seja para produzir nanocorpos ou outros fragmentos de anticorpos, você pode optar por animais derivados de camelos (camelos, alpacas, cabras) para imunização. Para produzir anticorpos monoclonais ou policlonais, a escolha da espécie adequada depende da quantidade de soro, antígeno e fonte do antígeno. O volume máximo de soro para coelhos é de 500 ml, o que requer uma quantidade menor de antígeno e é a principal opção para a produção de anticorpos policlonais. Para camundongos, o volume máximo de soro é de 2 ml, e para ratos, é de 20 ml, sendo geralmente a opção ideal para anticorpos monoclonais. Anticorpos produzidos a partir de cabras apresentam alta afinidade, e a Alpha Lifetech pode personalizar um plano de imunização exclusivo de acordo com suas necessidades.
É necessário usar antígenos juntamente com adjuvantes? Como escolher?

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Existem dois tipos de adjuvantes: à base de óleo e à base de água. O uso adequado de adjuvantes é crucial para induzir respostas robustas de anticorpos contra antígenos solúveis. A liberação sustentada dos adjuvantes permite o uso de doses menores de antígenos, resultando em respostas de anticorpos mais duradouras. A primeira injeção deve ser administrada em combinação com um adjuvante. Geralmente, recomenda-se o uso do adjuvante de Freund quando a quantidade de imunógeno é pequena.
Quais as precauções necessárias para a imunização de alpacas?

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(1) A seleção da alpaca e do antígeno de imunidade são fundamentais para o sucesso da imunização. Não é aconselhável escolher um camelo com proporções adequadas. A pureza e a conformação correta dos antígenos de imunidade são cruciais para a triagem de anticorpos adequados para aplicações subsequentes após a imunização com alpacas. A pureza dos antígenos proteicos geralmente não é inferior a 90%.

(2) Separação de linfócitos: A separação celular oportuna pode prevenir eficazmente a hemólise após a coleta de sangue para obter o melhor efeito de separação.

(3) O ciclo imunológico pode afetar a resposta imune: um intervalo imune de 1 a 2 semanas permite que as alpacas tenham uma boa resposta imune à maioria dos antígenos.

adjuvante desenvolvido independentemente

Nosso adjuvante de fórmula exclusiva foi otimizado para o sistema imunológico da alpaca, proporcionando maior potência e especificidade do que os adjuvantes tradicionais.

Administração de vacinas
padrão

Nós nos comprometemos a concluir a imunização dentro do prazo estipulado, fornecer soro com alto título de anticorpos e registrar cada etapa por meio de relatórios detalhados.

Controle de qualidade do projeto

Cada projeto passa por rigorosos processos de controle de qualidade para garantir a entrega de anticorpos que atendam aos altos padrões exigidos dos clientes.

claramenteAlpacaFundo

Temos uma população saudável de alpacas que dá suporte a vários programas de imunização.

Caso tenha alguma dúvida, não hesite em nos contatar a qualquer momento.

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