A tecnologia de phage display consiste em inserir o gene alvo exógeno em uma posição específica da proteína do capsídeo do fago e expressá-lo na superfície do fago sem afetar sua função normal. Após várias rodadas de seleção, obtém-se finalmente a proteína alvo com alta especificidade e elevada atividade biológica.

Bibliotecas de anticorpos de alta capacidade podem ser geradas usando essa tecnologia. O ciclo de triagem é breve, o processo operacional é simples e a gama de aplicações é extensa, permitindo a identificação de sequências ideais para peptídeos ou proteínas específicos. Em aplicações relacionadas a vírus, pesquisadores podem descobrir anticorpos que se ligam a epítopos virais críticos por meio da triagem de grandes bibliotecas de anticorpos. Esse processo pode impedir a entrada, a replicação ou os mecanismos de evasão imunológica dos vírus, estabelecendo assim uma base para o tratamento de doenças.

A tecnologia de phage display é mais amplamente utilizada do que a tecnologia de hibridoma, que se limita à produção de uma pequena quantidade de anticorpos contra imunógenos específicos. Em contraste, a tecnologia de phage display pode apresentar uma biblioteca completa de anticorpos derivados de diversas espécies imunes.

A tecnologia de phage display possui uma ampla gama de aplicações, incluindo a triagem de receptores de microrganismos patogênicos, o estudo de interações proteicas, o rastreamento da transmissão de sinais entre células, o diagnóstico de doenças em animais e o desenvolvimento de vacinas, entre outras áreas.

A tecnologia de phage display oferece inúmeras vantagens e pode ser aplicada em diversas áreas. No entanto, o principal desafio no desenvolvimento de anticorpos recombinantes utilizando o método de phage display é a complexidade e o custo associados ao processo. Essa abordagem exige a integração de técnicas de biologia molecular, incluindo mutação, clonagem e expressão, juntamente com análises imunológicas, bioquímicas e biofísicas para identificar e caracterizar os anticorpos desejados.

A apresentação de antígenos é um elo muito importante. Os métodos de apresentação de antígenos incluem principalmente a apresentação direta de antígenos revestidos, a apresentação indireta de antígenos revestidos, a apresentação de antígenos por meio de triagem de células inteiras, a apresentação de antígenos por meio de lipossomas, discos de nanofosfolipídios e VLPs (partículas semelhantes a vírus).

O método de revestimento direto é relativamente simples, mas a conformação do antígeno é facilmente alterada, enquanto o revestimento indireto é complexo, porém permite manter a conformação do antígeno e melhorar a eficiência da apresentação. A triagem celular pode simular o cenário real in vivo, mas apresenta o problema da ligação não específica. Os discos de nanofosfolipídios possuem tamanho reduzido, alta eficiência de entrega e boa estabilidade; as VLPs (partículas semelhantes a vírus) são fundidas ou revestidas com antígeno, apresentando alta imunogenicidade e segurança, além de poderem desencadear uma forte resposta imune.

Se a concentração for muito baixa, a probabilidade de ligação com o fago diminuirá, resultando em menor eficiência de triagem. Por outro lado, uma concentração excessivamente alta pode aumentar a probabilidade de ligação não específica, elevar o sinal de fundo e dificultar a identificação de clones positivos.

Métodos de fixação suaves podem ser adotados para evitar altas temperaturas, ácidos fortes e álcalis. Métodos de revestimento indireto e o sistema biotina-estreptavidina foram utilizados para reduzir os danos à estrutura do antígeno. Se o antígeno for uma proteína de membrana, ele pode ser exibido na superfície de células intactas ou utilizado para simular o ambiente da membrana, como em nanodiscos, para manter sua conformação natural de proteína de membrana.

Além de experimentos de rotina como ELISA, Western Blotting (WB) e Imunofluorescência (IF), as técnicas de detecção por Ressonância de Plásmon de Superfície (SPR) e Interferometria de Camada Biológica (BLI) podem ser empregadas para monitorar os processos de ligação e dissociação de anticorpos e antígenos em tempo real, permitindo a determinação de parâmetros de afinidade e cinética.

A técnica de phage display pode ser utilizada para gerar anticorpos monoclonais de alta afinidade para uma ampla gama de espécies produtoras de anticorpos, incluindo, entre outras, humanos, camundongos, ratos, coelhos, galinhas, camelos, alpacas, vacas, cães, ovelhas, macacos e tubarões.

A tecnologia de construção de bibliotecas de anticorpos de camundongo é bem estabelecida, economicamente viável e de curta duração experimental, tornando-a adequada para triagem preliminar de anticorpos e pesquisa básica. Anticorpos de coelho exibem forte afinidade e especificidade, com um espectro de reconhecimento de epítopos mais amplo em comparação com anticorpos de camundongo. Anticorpos humanos podem ser obtidos diretamente de bibliotecas de anticorpos humanos, evitando assim potenciais reações imunológicas que podem ocorrer quando anticorpos heterólogos são administrados ao corpo humano. Essa abordagem possui valor significativo na pesquisa e desenvolvimento de fármacos, particularmente na criação de anticorpos terapêuticos.

Os imunógenos animais são geralmente divididos em antígenos proteicos, antígenos polipeptídicos, antígenos de ácido nucleico e antígenos relacionados a patógenos, dentre os quais os antígenos relacionados a patógenos incluem antígenos virais (partícula viral completa, proteína viral, proteína não estrutural viral, etc.), antígenos bacterianos (extrato bacteriano completo, componente da parede celular, proteína secretada, toxina, etc.) e antígenos de parasitas.

Ajuste os imunógenos substituindo os antígenos imunes por proteínas recombinantes e as partículas virais de defesa pelas proteínas estruturais dos vírus. Ajuste o delineamento experimental e modifique a dosagem imune.

A imunogenicidade pode ser aumentada pela ligação de antígenos a proteínas carreadoras, como a albumina sérica bovina. Além disso, adjuvantes imunológicos, incluindo o adjuvante de Freund e o adjuvante de alumínio, podem ser empregados para prolongar o tempo de permanência in vivo e estimular a ativação e proliferação de células imunes, melhorando assim a imunogenicidade.

Uma biblioteca de anticorpos de fago é uma coleção de diversos anticorpos de fago criada pela montagem de um conjunto completo de genes da região variável de anticorpos em vetores de fago e sua expressão na superfície dos fagos. Esse processo resulta na formação de uma biblioteca de anticorpos de fago.

O processo geral de phage display envolve várias etapas principais: extração de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de animais imunizados, isolamento do RNA total e sua transcrição em DNA complementar (cDNA), amplificação do gene alvo por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR), clonagem do gene alvo em um vetor de fago e transformação do vetor em uma célula hospedeira para expressão. Esse processo resulta na construção de uma biblioteca de phage display, que pode identificar rapidamente anticorpos de alta afinidade. Posteriormente, essa biblioteca pode servir como um recurso valioso para o desenvolvimento de vacinas, medicamentos terapêuticos e reagentes de diagnóstico.

De acordo com a origem da biblioteca de anticorpos, as bibliotecas de anticorpos de fago podem ser categorizadas em bibliotecas de anticorpos de fago imunes e bibliotecas de anticorpos de fago nativos. A principal distinção entre esses dois tipos reside no fato de os animais terem sido vacinados ou não. Além disso, as bibliotecas de anticorpos nativos podem ser geradas por semissíntese ou síntese.

Existem dois índices principais para avaliar a qualidade de uma biblioteca de anticorpos: capacidade de armazenamento e diversidade. Uma grande capacidade de armazenamento, combinada com alta diversidade, garante a triagem eficaz de anticorpos com alta afinidade e especificidade.

No processo de elutriação biológica, a biblioteca de anticorpos é incubada com alvos fixos e, em seguida, lavada extensivamente para remover os fagos não reativos. Os conjugados são tipicamente eluídos usando uma solução ácida ou com alta concentração de sal e, posteriormente, amplificados em células hospedeiras adequadas para enriquecimento. Após 3 a 5 rodadas de triagem, obtêm-se anticorpos com alta afinidade.

Os métodos de triagem de fagos incluem principalmente a triagem em fase sólida, a triagem em fase líquida e a triagem baseada em células. A seleção de um método de triagem apropriado deve considerar as características das moléculas-alvo, os objetivos do processo de triagem e o ambiente laboratorial.

A triagem positiva é o método mais fundamental para a triagem de anticorpos de fagos que se ligam a proteínas-alvo. A triagem negativa serve para eliminar anticorpos não específicos. Durante o processo de triagem de anticorpos de fagos, anticorpos não específicos podem ser identificados devido à interferência do marcador do antígeno-alvo, de materiais ou de outros antígenos com semelhanças estruturais ao antígeno-alvo. Nesses casos, a triagem negativa pode aumentar a eficiência do processo de triagem.

Os métodos para verificação de anticorpos normalmente incluem ELISA, Western Blotting (WB), citometria de fluxo, imunoprecipitação (IP), imunofluorescência (IF), imuno-histoquímica e várias outras técnicas experimentais. A Alpha Lifetech possui vasta experiência em detecção de anticorpos e conta com uma equipe experimental profissional, garantindo a eficácia dos anticorpos em experimentos subsequentes.