Plataforma de Desenvolvimento de Humanização de Anticorpos

Anticorpos humanizados desencadeiam uma resposta mínima ou nenhuma do sistema imunológico humano. De acordo com a Cognitive Market Research, o mercado global de humanização de anticorpos atingiu US$ 92,5 milhões em 2024 e deverá crescer a uma taxa composta anual (CAGR) de 13% entre 2024 e 2031. A Alpha Lifetech possui uma plataforma consolidada de humanização de anticorpos, com uma taxa de sucesso superior a 98%. Oferecemos diversas estratégias de humanização, incluindo enxerto de CDR, enxerto de SDR, rearranjo de cadeias, phage display, entre outras, que podem ser selecionadas de acordo com as suas necessidades experimentais. Podemos fornecer não apenas a humanização de anticorpos de diversas espécies, como camundongos, coelhos, alpacas, camelos, etc., mas também a humanização de anticorpos em vários formatos, como scFv, Fab e nanocorpos. Contamos com pessoal técnico especializado para fornecer serviços de produção, purificação e validação de anticorpos, incluindo produção de anticorpos monoclonais de camundongo, produção de anticorpos quiméricos, expressão e purificação de anticorpos humanizados, além de caracterização e análise de anticorpos humanizados. Com alta taxa de sucesso, alta pureza e baixa imunogenicidade, garantimos a produção de anticorpos humanizados.

Introdução à humanização de anticorpos

A terapia com anticorpos monoclonais pode ser usada para o tratamento de doenças autoimunes, câncer e outras doenças. Os anticorpos monoclonais são produzidos pela imunização de camundongos ou outros animais. Quando usados para tratar doenças na fase final da produção de anticorpos monoclonais, a imunogenicidade de anticorpos não humanos não pode ser ignorada. O princípio fundamental da humanização é integrar resíduos de estrutura não humana, como as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) hipervariáveis, na estrutura humana, produzindo sequências que retêm as características originais do anticorpo, ao mesmo tempo que previnem a imunogenicidade. A imunização de camundongos e a subsequente humanização da sequência do anticorpo murino permanecem duas das principais vias para a descoberta de anticorpos terapêuticos, que passam principalmente por várias etapas: produção de anticorpos em camundongos, quimerização de anticorpos monoclonais, anticorpo monoclonal quimérico murino-humano e o processo de desenvolvimento de anticorpos monoclonais totalmente humanizados. Atualmente, a pesquisa inclui principalmente camundongos transgênicos (transferência de genes de células B humanas para camundongos), triagem de alto rendimento usando tecnologia de exibição em levedura ou fago, enxerto de CDR (inserção de CDRs parentais em sequências humanas), resíduos de determinação específicos para transplante (SDR), rearranjo de estrutura e outros métodos.

Humanização de anticorpos - Alpha Lifetech

Figura 1: Visão geral esquemática da humanização de anticorpos, desde anticorpos murinos (domínios verdes) até anticorpos totalmente humanos.

Estratégia de humanização de anticorpos

Enxerto de CDR

O enxerto de CDR é realizado por meio de um sistema de expressão em células de mamíferos baseado na tecnologia de DNA recombinante, e suas principais etapas são:

(1) Desenvolver anticorpos correspondentes em camundongos (ou fontes não humanas), isolar o DNA que codifica os anticorpos e cloná-los em vetores para sequenciamento (ou realizar diretamente o sequenciamento de célula única).

(2) Determinar a sequência de DNA correspondente ao CDR do anticorpo e determinar a especificidade de ligação ao alvo;

(3) Selecionar a região de estrutura humana (FR) para transplantar CDRs não humanos e construir um novo gene de anticorpo.

(4) Realizar uma análise tridimensional de conflitos entre CDRs não humanos e FRs humanos para gerar mutações de recuperação para estabilizar o loop e evitar a perda de afinidade ou integridade estrutural do anticorpo humanizado final.

Figura 2: Visão geral esquemática do enxerto da região determinante de complementaridade (CDR).

Reorganização de frameworks

A técnica de recombinação de estruturas (framework shuffling) baseia-se nas tecnologias de phage display e de triagem de bibliotecas de fagos para obter anticorpos de alta afinidade. Oligonucleotídeos que codificam as estruturas da cadeia pesada de anticorpos humanos são usados como moldes, as regiões CDR são codificadas como primers e a amplificação por PCR é realizada para desnaturar o produto da PCR e obter DNA de fita simples. O DNA de fita simples dos genes VL e VH, purificado com estreptavidina, é reconstruído em vetores usando a DNA ligase T4 e enzimas de restrição, incubado com bacteriófagos e amplificado por estes, resultando na construção de uma biblioteca de phage display. Três rodadas de triagem com os antígenos correspondentes são realizadas e os clones positivos são finalmente verificados por ELISA e outros métodos.

Figura 3: Ilustração esquemática das estratégias de humanização por enxerto de região determinante de complementaridade (CDR) e embaralhamento de estrutura (FR). (A) O procedimento principal de enxerto de CDR. (B) O processo principal de embaralhamento de FR. (Fonte de referência: Wang Yongmei, et al., Comparação de “reorganização de estrutura” e “enxerto de CDR” na humanização de um anticorpo murino anti-PD-1.)

Apresentação de fagos

A produção de anticorpos humanizados baseia-se no método de exibição de anticorpos específicos na superfície de bacteriófagos, construídos principalmente por meio de bibliotecas de fagos com anticorpos humanos. A fonte da biblioteca são células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) isoladas de sangue periférico humano, das quais são selecionadas as sequências correspondentes. Essa sequência contém a sequência humana completa, mas os anticorpos produzidos são fragmentos de anticorpos, como scFv, Fab e nanocorpos.

Fluxo de trabalho do serviço de humanização de anticorpos

Etapas do serviço	Padrão de controle de qualidade	Linha do tempo
Isolamento de anticorpos	Pureza >95%	1 a 2 semanas
Análise de Sequência	Identificação precisa de sequências não humanas	1 semana
Enxerto de CDR e Enxerto de Estrutura	Integração e expressão bem-sucedidas	2 a 3 semanas
Expressão e Purificação	Alto rendimento e pureza	2 a 3 semanas
Validação Funcional	Avaliação de afinidade e especificidade	1 semana