Serviço de Pesquisa de Aptâmeros

Introdução aos aptâmeros

Os aptâmeros são moléculas de ácido nucleico de cadeia simples (como DNA ou RNA) selecionadas in vitro a partir de uma biblioteca de oligonucleotídeos sintéticos com sequências atribuídas aleatoriamente por um processo chamado triagem SELEX, que envolve múltiplas rodadas de seleção iterativa. Os principais componentes dos serviços de desenvolvimento de aptâmeros oferecidos pela Alpha Lifetech incluem a construção de bibliotecas de aptâmeros, a triagem SELEX de aptâmeros, o sequenciamento SELEX de aptâmeros, a análise de sequências de aptâmeros e outras análises de aptâmeros.

O sequenciamento SELEX combina a triagem de aptâmeros SELEX com o sequenciamento de alto rendimento. Através do sequenciamento de aptâmeros SELEX, a sequência específica do aptâmero ligado ao alvo pode ser determinada de forma eficiente, fornecendo dados básicos para análises e aplicações subsequentes da sequência do aptâmero.

Os aptâmeros têm sido amplamente utilizados em pesquisa científica, tratamento de doenças, construção de biossensores, descoberta de medicamentos e monitoramento ambiental. No entanto, os aptâmeros oligonucleotídicos selecionados in vitro degradam-se facilmente in vivo e podem até apresentar toxicidade. Portanto, após a otimização dos aptâmeros selecionados, é necessária uma análise in vitro para avaliar o sucesso do desenvolvimento dos aptâmeros. De acordo com as diferentes necessidades de análise dos clientes, a Alpha Lifetech oferece uma variedade de estratégias de análise de aptâmeros para escolha do cliente.

Figura 1. Diagrama da análise de aptâmeros. Fonte de referência:Thevendran R, Citartan M. 2022. Ensaios para estimar a afinidade de ligação de aptâmeros..

Introdução ao Serviço de Pesquisa de Aptâmeros

Análise de estabilidade do aptâmero

Experimento de degradação por nuclease

Ao incubar o aptâmero com diferentes tipos de nucleases (como DNase, RNase, etc.) sob condições específicas, observa-se a degradação do aptâmero, avaliando assim sua capacidade de resistência à degradação. Isso é benéfico para determinar a estabilidade e a durabilidade do aptâmero em aplicações práticas.

Método de marcação fluorescente

A estabilidade do aptâmero é avaliada indiretamente através da marcação dos fluoróforos no aptâmero e da observação das alterações no sinal de fluorescência antes e depois da ligação com o alvo. Por exemplo, quando um aptâmero se liga a um alvo, sua conformação pode mudar, resultando em um sinal de fluorescência aumentado ou diminuído.

Análise de estabilidade térmica

A estabilidade térmica do aptâmero é avaliada medindo-se a variação de sua temperatura de fusão (valor de Tm) em diferentes temperaturas. Quanto maior a temperatura de fusão do aptâmero, melhor sua estabilidade térmica.

Análise de estabilidade dinâmica

A ressonância de plasmon de superfície (SPR) e outras tecnologias foram utilizadas para monitorar o processo de ligação e desacoplamento entre o aptâmero e o alvo em tempo real, obter parâmetros dinâmicos (como constante de taxa de ligação, constante de taxa de dissociação, etc.), compreender melhor o mecanismo de interação entre o aptâmero e o alvo e avaliar sua estabilidade dinâmica.

Análise de estabilidade estrutural

A cristalografia de raios X, a ressonância magnética nuclear (RMN) e outras técnicas de biologia estrutural foram utilizadas para analisar a estrutura tridimensional do aptâmero e sua estabilidade estrutural.

Análise específica de aptâmeros

ensaio de ligação de aptâmero

A afinidade é avaliada por meio de ensaios de ligação de aptâmeros para medir a constante de ligação entre o aptâmero e a molécula-alvo, como a constante de dissociação Kd. Um valor de Kd mais baixo indica maior afinidade. O ensaio de ligação de aptâmeros permite selecionar candidatos a medicamentos com alta capacidade de ligação, possibilitando a realização de estudos subsequentes de farmacodinâmica e farmacocinética.

Experimento de triagem reversa

O ensaio de triagem reversa é um método de triagem para excluir rapidamente moléculas não-alvo de um grande número de moléculas candidatas. A triagem reversa é projetada para excluir moléculas que não possuem a propriedade ou função desejada. A chave para a triagem reversa é selecionar marcadores ou condições apropriadas que permitam a identificação e remoção de moléculas não-alvo durante o processo de triagem. Neste experimento, a seleção de moléculas não-alvo é crucial. Deve-se garantir que as moléculas não-alvo selecionadas sejam representativas de substâncias que possam interferir na triagem de aptâmeros e que os possíveis fatores de interferência sejam cobertos da forma mais completa possível.

Experimento de inibição competitiva

Ao adicionar competidores em excesso (como moléculas com estrutura semelhante à da molécula alvo) ao sistema de ligação do aptâmero à molécula alvo, observa-se a alteração na capacidade de ligação entre o aptâmero e a molécula alvo. Se a capacidade do aptâmero de se ligar à molécula alvo for significativamente reduzida, isso indica que o aptâmero possui alta especificidade.

Em alguns casos, experimentos de inibição competitiva podem ser usados como parte de experimentos de triagem reversa ou como um complemento a eles. Por exemplo, no processo de triagem de medicamentos, a capacidade da molécula do medicamento de se ligar à proteína-alvo pode ser avaliada por experimentos de inibição competitiva, e então experimentos de triagem reversa podem ser usados para remover os compostos que se ligam muito fortemente a células ou tecidos normais.

Análise de citotoxicidade de aptâmeros

Existem diversos métodos experimentais para análise da citotoxicidade de aptâmeros, projetados para avaliar os efeitos dos aptâmeros na sobrevivência, proliferação ou função celular.

Métodos	Introdução detalhada	Vantagem	Desvantagem
Método de detecção de MTT	O ensaio MTT é um método baseado na atividade enzimática das mitocôndrias de células vivas. A succinato desidrogenase presente nas mitocôndrias de células vivas pode reduzir o MTT exógeno a cristais azul-púrpura insolúveis em água, formando o formazan, que é depositado na célula. Células mortas não possuem essa função. A dissolução desses cristais com dimetilsulfóxido (DMSO) e a detecção da absorbância em comprimentos de onda específicos (como 490 nm ou 570 nm) em um leitor enzimático podem refletir indiretamente o número de células vivas e, assim, avaliar a citotoxicidade do aptâmero.	Alta sensibilidade, economia e conveniência	Carga de trabalho pesada, solventes orgânicos podem causar danos às células; apenas os resultados experimentais finais podem ser obtidos, e o processo completo de citotoxicidade não pode ser visualizado.
Método de detecção CCK-8	O kit de contagem celular-8 (CCK-8) é um método de detecção colorimétrica não radioativo e de alta sensibilidade. O CCK-8 contém WST-8, que é reduzido pela desidrogenase nas mitocôndrias das células vivas para produzir o corante laranja metil zan, altamente solúvel em água. A quantidade de corante metil zan produzido está linearmente relacionada ao número de células vivas, e esse número pode ser indiretamente estimado pela medição da absorção de luz do corante metil zan no comprimento de onda de 450 nm, permitindo avaliar a citotoxicidade do aptâmero.	Operação simples, sem necessidade de lavar as células, detecção rápida, ampla faixa de detecção linear, alta sensibilidade, boa repetibilidade, baixa citotoxicidade.	Alto custo dos reagentes; às vezes é difícil determinar se a redução da absorbância se deve a uma diminuição no número de células vivas ou a uma diminuição na atividade da própria desidrogenase celular.
Método de detecção de LDH	A LDH (lactato desidrogenase) é uma enzima estável no citoplasma das células. Quando a membrana celular é danificada, a LDH é liberada para o meio extracelular. A LDH catalisa a reação do ácido lático com o piruvato, que reage com sais de tetrazólio (INT) para formar uma substância cristalina púrpura. A medição da absorbância da LDH em um comprimento de onda específico (como 490 nm) permite avaliar o grau de dano celular e, consequentemente, a citotoxicidade do aptâmero.	Reflete diretamente a taxa de morte celular, causa menos danos às células e não há contaminação por isótopos radioativos.	A necessidade de retirar as células da incubadora com frequência torna a operação mais complexa; apenas os resultados experimentais finais podem ser obtidos, e o processo completo de citotoxicidade não pode ser visualizado.
Análise de imagens de células vivas em tempo real	Utilizando um analisador de imagens de células vivas em tempo real, o instrumento foi colocado na incubadora para observar e registrar todo o processo do ciclo de crescimento celular em tempo real. A citotoxicidade dos aptâmeros pode ser avaliada pela análise das alterações morfológicas e das curvas de crescimento das células. Este método permite obter resultados em vídeo e quantificados dos processos citotóxicos, mantendo o ambiente de crescimento celular estável.	É possível monitorar o processo citotóxico em tempo real, por meio de imagens não destrutivas, reduzindo a interferência e os danos às células; tanto os resultados em vídeo quanto os quantitativos estão disponíveis para análise aprofundada.	Os custos dos equipamentos são elevados e exigem habilidades operacionais profissionais e capacidade de análise de dados.

KACHI

Vantagens do Serviço de Pesquisa de Aptâmeros

Controle Total de Qualidade

Aptâmeros otimizados com maior estabilidade

Econômico e eficiente. Preço mais competitivo, melhor serviço.

Locais de pesquisa abrangentes e múltiplos métodos de pesquisa

Serviços profissionais de consultoria pré-venda e suporte pós-venda.

Ampla experiência em análise de aptâmeros

Equipe de P&D de alto nível

Serviços personalizados relacionados a aptâmeros

Voltar à página da Plataforma de Desenvolvimento de Aptâmeros

Caso tenha alguma dúvida, não hesite em nos contatar a qualquer momento.

Leave Your Message

Serviço em destaque

0102