Em 1960, foi proposto o conceito de anticorpos biespecíficos. Anticorpos biespecíficos, também conhecidos como anticorpos monoclonais biespecíficos, são anticorpos sintetizados artificialmente por meio de tecnologia de engenharia genética. Como anticorpos artificiais projetados, os anticorpos biespecíficos geralmente pertencem à subclasse IgG e contêm um fragmento de ligação ao antígeno direcionado à subunidade CD3. Os anticorpos biespecíficos possuem dois sítios de ligação ao antígeno específicos que podem se ligar e reconhecer simultaneamente dois antígenos diferentes ou dois epítopos diferentes de um antígeno. Comparados aos anticorpos monoclonais, os anticorpos biespecíficos possuem um sítio de ligação ao antígeno específico adicional, apresentando, portanto, maior especificidade e capacidade de direcionamento, o que permite atingir células tumorais com mais precisão e reduzir a toxicidade fora do alvo. Os anticorpos biespecíficos podem desempenhar simultaneamente múltiplas funções biológicas, como recrutar células imunes, bloquear vias de sinalização e matar diretamente células tumorais. Os primeiros anticorpos biespecíficos eram preparados principalmente por meio de conjugação química ou fusão celular, mas esse método pode ter progredido lentamente devido à combinação aleatória e à dificuldade em isolar a combinação alvo. Com o desenvolvimento contínuo da tecnologia de engenharia genética, muitas novas plataformas tecnológicas foram desenvolvidas, como knots in holes (KIH), CrossMab, DVD Ig, etc. Essas plataformas resolvem eficazmente problemas como incompatibilidades entre as cadeias pesadas e leves, e melhoram a uniformidade e o rendimento de anticorpos biespecíficos.

Os principais métodos para a produção de anticorpos biespecíficos incluem o acoplamento químico, o método de hibridoma de quatro fontes e a preparação de anticorpos por engenharia genética. Dentre eles, o método de acoplamento químico acopla duas IgG intactas ou dois fragmentos de anticorpo F(ab')₂ em anticorpos biespecíficos utilizando agentes de acoplamento químico como ftalimida e ácido ditioacilbenzóico. Este método é simples e fácil de operar, mas pode danificar o sítio de ligação ao antígeno, reduzir a atividade do anticorpo, e o próprio agente de acoplamento também apresenta certo grau de carcinogenicidade. O método de hibridoma de quatro fontes baseia-se na fusão de células somáticas de duas linhagens celulares de hibridoma diferentes para expressar a IgG de camundongo correspondente. Através da tecnologia de engenharia genética, os anticorpos podem ser geneticamente modificados para formar anticorpos biespecíficos. Dois anticorpos monoclonais diferentes são construídos, e os fragmentos Fab ou as regiões variáveis ​​das cadeias pesada e leve dos dois anticorpos são clivados separadamente. Através de reação de ligação cruzada ou tecnologia de recombinação de cadeias, os dois fragmentos são combinados para formar um anticorpo biespecífico. Embora a complexidade da tecnologia de engenharia genética seja relativamente alta, atualmente é o método mais utilizado para a produção de anticorpos biespecíficos, visando ajustar a estrutura e a função dos anticorpos. Ao desenvolver anticorpos biespecíficos, o princípio da reatividade cruzada pode ser utilizado, porém, essa reatividade cruzada pode causar reações não específicas, portanto, deve ser cuidadosamente considerada na aplicação prática do desenvolvimento de anticorpos biespecíficos, como na terapia com anticorpos biespecíficos.

A purificação de anticorpos biespecíficos é o processo de isolamento e purificação de anticorpos-alvo de alta pureza. Dois métodos, centrifugação e filtração profunda, são utilizados para remover algumas impurezas solúveis. O anticorpo biespecífico alvo é inicialmente capturado por cromatografia de afinidade. Para anticorpos biespecíficos do tipo IgG, utiliza-se cromatografia de afinidade com proteína A, enquanto para anticorpos biespecíficos não semelhantes a IgG, pode-se utilizar cromatografia de afinidade baseada em cadeias leves. Posteriormente, o anticorpo é incubado em condições de baixo pH por um determinado período de tempo, o que causa a ruptura da estrutura proteica na superfície do envelope viral, resultando na perda da capacidade de infectar células. Uma filtração profunda intermediária é realizada para remover ainda mais impurezas, como proteínas da célula hospedeira (HCP). A pureza dos anticorpos é aprimorada por meio de métodos como cromatografia de troca iônica, e quaisquer vírus residuais são removidos por técnicas de nanofiltração ou ultrafiltração. Finalmente, a amostra é concentrada e substituída por um tampão de formulação adequado.