Serviço de Análise de Interações Proteína-Proteína
A Alpha Lifetech também pode fornecer aos clientes ensaios de proteínas, análise de interação proteína-proteína, ensaio de interação proteína-proteína (CO-IP, Western Blot, ensaio de imunoprecipitação de cromatina) e ensaio de função proteica para atender às necessidades experimentais de diferentes clientes.
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Serviço de Análise de Interações Proteína-Proteína
A Alpha Lifetech está profundamente envolvida em ensaios de proteínas há muitos anos, tendo construído uma plataforma sólida para ensaios de função proteica e dominado uma variedade de meios técnicos para verificar a interação de proteínas, o que pode economizar tempo de pesquisa científica ou de projeto, ao mesmo tempo que fornece resultados estáveis.
A Alpha Lifetech também pode fornecer aos clientes ensaios de proteínas, análise de interação proteína-proteína, ensaio de interação proteína-proteína (CO-IP, Western Blot, ensaio de imunoprecipitação de cromatina) e ensaio de função proteica para atender às necessidades experimentais de diferentes clientes.
Introdução ao ensaio de interação proteína-proteína
As proteínas são as moléculas executoras mais importantes em qualquer forma de vida, respondendo às instruções armazenadas no material genético. Frequentemente, as proteínas desempenham suas funções atuando como interagentes que se combinam com outras proteínas, o que se torna mais evidente quando a função de uma proteína é examinada no contexto real de uma célula. Identificar as interações entre proteínas é crucial para a investigação bioquímica de uma proteína específica. A seguir, apresentamos alguns tipos comuns de análise de interação proteica:
Ensaio de coimunoprecipitação
O princípio do método de coimunoprecipitação consiste em misturar a proteína alvo, o anticorpo específico e as esferas magnéticas de proteína A/G para incubação. O sobrenadante contendo a proteína não ligada é descartado por meio da adsorção das esferas magnéticas em um suporte magnético, e as esferas magnéticas são lavadas para remover a proteína e outras impurezas, a menos que estejam especificamente ligadas.
Figura 1. Diagrama esquemático dos ensaios de Co-IP.(Fonte de referência: Ensaio de coimunoprecipitação - PubMed (nih.gov))
Ensaio de pull-down
O ensaio de pull-down consiste em fixar a proteína conhecida em uma microesfera magnética e adicionar a substância a ser detectada. O eluato é analisado para detectar a adsorção das proteínas interagentes.
Em 1988, Smith et al. purificaram a proteína de fusão GST, que foi aplicada em ensaios de pull-down, denominados Gst pull-down, que consistem em adicionar uma etiqueta GST à proteína alvo, capturar a proteína interagente por meio de GSH, eluir a ligação e verificá-la por meio de ensaios de Western blot.
Figura 2. Diagrama esquemático dos ensaios de pull-down com GST.(Fonte de referência: Ensaio de GST Pull-Down para estudar a ligação de PIF4 in vitro - PubMed (nih.gov) )
Seu método de precipitação consiste em usar íons metálicos como níquel ou cobalto como meio, purificar a proteína por meio de cromatografia de afinidade e eluir a ligação por meio de um experimento de Western blot para verificação.
Além disso, existem os ensaios de pull-down de DNA (ensaio de ligação proteína-DNA), pull-down de RNA (ensaio de interação proteína-RNA) e pull-down de pequenas moléculas.
O ensaio de ligação de proteínas ao DNA (DNA Pull-down) é um método in vitro para determinar a ligação de proteínas ao DNA. A ligação de proteínas específicas ao DNA alvo é detectada por ensaios de Western blot (WB); fragmentos de DNA desconhecidos ligados a proteínas são identificados por espectrometria de massa (MS).
O ensaio de interação proteína-RNA (RNA Pull-down) é um método in vitro para determinar a ligação do RNA a proteínas. A ligação de proteínas específicas ao RNA alvo é detectada por ensaios de Western blot (WB); fragmentos de RNA desconhecidos ligados a proteínas são identificados por espectrometria de massa (MS).
O ensaio de pull-down de pequenas moléculas (SM pull-down assay) permite identificar proteínas-alvo que se ligam especificamente a pequenas moléculas e, quando combinado com a espectrometria de massa (MS), possibilita a triagem precisa dessas proteínas-alvo. Esse método pode ser dividido em dois tipos: o de marcação in vitro e o de ortogonalidade biológica.
Experimento WB
O experimento de Western blot (também conhecido como Western Blot ou WB) consiste na reação específica entre antígeno e anticorpo. O princípio básico é separar proteínas desnaturadas por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e transferi-las para uma membrana de fase sólida (como uma membrana de PVDF ou nitrocelulose) por meio de transferência por rotação úmida ou semi-seca. Após o bloqueio (com BSA, soro de leite, etc.), o anticorpo primário é aplicado para se ligar especificamente à proteína, e o anticorpo secundário marcado com fluoresceína é adicionado após a lavagem da membrana. A ligação do anticorpo secundário com o anticorpo primário permite a visualização da proteína alvo pelo desenvolvimento da cor do substrato e quimioluminescência. Geralmente, esse método é utilizado para determinar se uma proteína específica está presente na amostra e para analisar, de forma aproximada, seu nível de expressão.
Comparação de métodos de interação proteína-proteína
Os ensaios de precipitação de proteínas são semelhantes aos ensaios de coimunoprecipitação (Co-IP), ambos pertencentes à detecção de interações proteicas. A diferença entre os dois métodos reside no fato de que os ensaios de Co-IP obtêm proteínas interagentes de proteínas conhecidas, o que confere certa autenticidade, mas não permite confirmar se a interação entre as proteínas é direta ou indireta. Os ensaios de precipitação, por sua vez, visam identificar proteínas desconhecidas interagindo com proteínas conhecidas. Eles podem confirmar diretamente se a proteína conhecida interage com a proteína detectada, mas não permitem determinar o padrão de interação in vivo.
A tecnologia de coimunoprecipitação é utilizada para analisar se existe interação entre duas ou mais proteínas, com base em experimentos de imunoprecipitação. Comparada a outras técnicas experimentais de análise de interação proteica (GST Pull-down, Western Blot, ensaio de imunoprecipitação de cromatina, etc.), a tecnologia Co-IP apresenta maior especificidade, sensibilidade e repetibilidade, o que permite evitar a interferência de ligações não específicas e refletir a interação de proteínas em seu estado natural.
| GST (Imposto sobre Bens e Serviços) - Baixar | Copropriedade intelectual | WB | |
|---|---|---|---|
| Vantagem | *Fácil de operar *Adequado para a purificação de diversas proteínas | *Para análise de interação in vivo *Pode ser identificado com proteína a jusante | *Alta especificidade *Qualitativo e quantitativo in vitro |
| Limitação | *Talvez ligação não específica *É necessária uma validação adicional da interação. | *Forte dependência de anticorpos *Pode ocorrer ligação não específica | *Demorado *Difícil de usar para análises de proteínas em larga escala |
| Exemplo de aplicação | *Identificar interações *Complexo proteico purificado | *Estudar a transdução de sinal *Mecanismo da doença | Análises subsequentes de interações proteína-proteína, proteína-DNA e proteína-RNA |
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16/07/2018 
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