Serviço de triagem de biblioteca de exibição de superfície de levedura

A Alpha Lifetech é especializada na construção de bibliotecas de anticorpos por meio da tecnologia de phage display, oferecendo a capacidade de gerar diferentes formatos de bibliotecas de levedura e selecioná-las para anticorpos de alta afinidade e especificidade para clientes em todo o mundo. Com uma equipe de pesquisadores experientes, tecnologia e equipamentos avançados, podemos construir bibliotecas de levedura direcionadas a uma ampla gama de proteínas relacionadas a doenças. Oferecemos tecnologias de phage display e yeast display, incluindo protein yeast display, small molecule yeast display, antibody yeast display, etc.

Nossas bibliotecas de anticorpos em levedura possuem grande capacidade e alta diversidade, o que proporciona uma base sólida para a triagem eficaz de sequências específicas de anticorpos. Podemos construir diferentes formatos de bibliotecas de anticorpos em levedura (IgG, scFv, VHH, Fab), bibliotecas de proteínas, bibliotecas de peptídeos, bibliotecas de cDNA, etc., de acordo com suas necessidades. Além disso, também podemos desenvolver bibliotecas de anticorpos com diversas propriedades, incluindo bibliotecas imunes, bibliotecas naturais, bibliotecas sintéticas, bibliotecas semissintéticas e bibliotecas de anticorpos para doenças.

Introdução ao Sistema de Exibição de Leveduras

A tecnologia de apresentação em superfície de levedura é um método para exibir proteínas recombinantes na superfície da levedura por meio de fusão gênica. O sistema de apresentação em levedura mais comum utiliza a proteína alvo fundida à extremidade C-terminal da subunidade Aga2p da proteína de acasalamento da lectina alfa, consistindo principalmente de marcadores de epítopo em ambos os lados da proteína alvo: o marcador de hemaglutinina (HA) de 9 aminoácidos na extremidade N-terminal e o marcador c-myc de 10 aminoácidos na extremidade C-terminal. A subunidade Aga2p, com 69 aminoácidos, liga-se à subunidade Aga1p da lectina alfa, com 725 aminoácidos, por meio de duas ligações dissulfeto, e a Aga1p é ancorada à parede celular por meio de uma ligação covalente de β-1,6-glucano. Portanto, a proteína alvo é exibida na superfície das células de levedura e subsequentemente reconhecida pelo ligante correspondente. Proteínas funcionais são separadas de bibliotecas por meio de triagem por citometria de fluxo.

Figura 1: Princípio da exposição da levedura na superfície. (Fonte da figura: Aplicações da tecnologia de apresentação em superfície de leveduras para engenharia de proteínas.)

Introdução à Biblioteca de Exibição na Superfície da Levedura

A triagem por apresentação em levedura baseia-se na apresentação na superfície da levedura, sendo utilizada principalmente para selecionar bibliotecas de anticorpos direcionadas a proteínas da superfície celular. Devido à baixa ligação não específica entre as células de levedura e outras superfícies celulares, a seleção biológica em levedura permite selecionar grandes bibliotecas de ligação para encontrar clones raros.

Serviço de triagem de biblioteca de exibição de superfície de levedura

Prepare plasmídeos e cultive células de levedura, sintetize o DNA que codifica a proteína alvo e clone-o em um vetor de expressão de levedura contendo promotores induzíveis, peptídeos sinalizadores e genes alvo fundidos a proteínas de superfície (como Aga2p). O gene que codifica a proteína alvo pode ser fundido ao gene que codifica a proteína da parede celular da levedura (geralmente Aga2p), e o gene fundido pode ser transformado em células de levedura por eletroporação. Após a transformação, as células de levedura que expressam genes de anticorpos em sua superfície podem ser submetidas a testes de triagem antígeno-específica: a biblioteca de levedura é incubada com o antígeno alvo e as células de levedura que se ligam especificamente a ele são selecionadas. Usando a triagem de células ativadas por fluorescência (FACS) para isolar células de levedura que exibem proteínas com as características desejadas, a triagem da biblioteca de levedura pode ser realizada com um tamanho máximo de biblioteca de ~10⁸-10⁹ células de levedura. Clones positivos podem então ser isolados para análises posteriores ou aplicações subsequentes. Uma vez identificados clones de anticorpos específicos na biblioteca de anticorpos, eles podem ser posteriormente caracterizados, produzidos em massa e purificados utilizando técnicas como a cromatografia de afinidade proteína A/G para completar todo o processo de triagem por apresentação em levedura e produção de anticorpos.

Processo de triagem de biblioteca de exibição de leveduras

Figura 2. Processo de triagem da biblioteca de exibição em levedura.

Fluxo de trabalho do serviço de triagem da biblioteca de leveduras

Passos	Conteúdo do serviço	Linha do tempo
Preparação de Antígenos	Tipo de antígeno: Caso o cliente possa fornecer os antígenos, as amostras correspondentes deverão ser entregues de acordo com o tipo: proteínas recombinantes requerem de 3 a 3,5 mg com pureza superior a 85%; pequenas moléculas precisam ser conjugadas com pureza superior a 90%; peptídeos sintetizados precisam ser conjugados com pureza superior a 90%; amostras como vírus precisam ser inativadas; RNA precisa ser inspecionado para evitar degradação. Os tipos de antígenos mencionados acima também podem ser personalizados para síntese.	2 a 3 semanas
Imunidade Animal	O número de imunizações em animais é 5, e é necessário determinar se o número de imunizações deve ser aumentado com base nos testes de titulação sérica. Imunidade antigênica: potência do antígeno proteico/viral > 10⁵; potência do antígeno peptídico/de pequena molécula > 10⁴	5 a 6 semanas
Preparação do cDNA molde	Separe as PBMCs do plasma, extraia o RNA total (kit de extração de RNA) e faça a conversão reversa para cDNA.	1 dia
Construção de Biblioteca	Utilizando o cDNA da biblioteca como molde, o gene VHH foi amplificado por duas rodadas de PCR e um vetor de expressão em levedura para splicing do gene VHH foi construído. O vetor foi transformado em células de levedura por eletroporação para construir uma biblioteca de anticorpos. Quarenta e oito clones foram selecionados aleatoriamente e a taxa de positividade (>90%) foi identificada por PCR; a capacidade da biblioteca (10^7-10^8) foi calculada e o sequenciamento NGS foi utilizado para determinar a taxa de inserção correta da biblioteca (>90%) e a diversidade da biblioteca.	2 semanas
Exibição na Biblioteca	O protocolo padrão consiste em três rodadas de triagem: triagem FACS com proteínas marcadas por fluorescência, seguida por sequenciamento NGS na terceira rodada. Clones positivos foram selecionados para expressão por indução em grama única e detecção por ELISA. Todos os clones positivos foram selecionados para sequenciamento genético, e diferentes sequências da região CDR foram selecionadas.	2 a 3 semanas
Verificação de anticorpos	A construção de vetores de expressão adequados para sequências de anticorpos pode facilitar a expressão de anticorpos, a purificação de anticorpos, a validação da ligação anticorpo-antígeno por ELISA e BLI para verificar a afinidade do anticorpo e o bloqueio por citometria de fluxo para validar a função celular.	1 semana

Caso de triagem de biblioteca de exibição de superfície de levedura

Na literatura sobre plataformas de apresentação em superfície de levedura para a descoberta rápida de nanocorpos com seletividade conformacional, os autores estabeleceram uma plataforma completa de descoberta de nanocorpos in vitro baseada na apresentação em superfície de levedura. Primeiramente, uma biblioteca sintética de nanocorpos foi projetada a partir de genes de camelo. A Figura D mostra que o nanocorpo possui uma etiqueta HA na extremidade carboxílica e, em seguida, é fixado covalentemente à parede celular da levedura. A Figura E mostra o processo de triagem de nanocorpos. Leveduras com nanocorpos de afinidade ao antígeno foram isoladas, amplificadas e selecionadas repetidamente para anticorpos por FACS. Os autores descobriram nanocorpos com seletividade conformacional direcionados a dois GPCRs humanos diferentes por meio dessa plataforma.