Tehnologia de afișare a fagilor constă în inserarea genei țintă străine în poziția specifică a proteinei capsidei fagice și exprimarea genei străine pe suprafața fagului fără a afecta funcția normală a acestuia. După mai multe runde de screening, s-a obținut în final proteina țintă cu specificitate puternică și activitate biologică ridicată.

Biblioteci de anticorpi de mare capacitate pot fi generate folosind această tehnologie. Ciclul de screening este scurt, procesul operațional este simplu, iar gama de aplicații este extinsă, permițând identificarea secvențelor optime pentru peptidele sau proteinele vizate. În aplicațiile legate de virusuri, cercetătorii pot descoperi anticorpi care se leagă de epitopi virali critici prin screening-ul bibliotecilor mari de anticorpi. Acest proces poate împiedica mecanismele de intrare, replicare sau evaziune imună ale virusurilor, stabilind astfel o bază pentru tratamentul bolilor.

Tehnologia de afișare fagică este mai utilizată pe scară largă decât tehnologia hibridomului, care se limitează la producerea unei cantități mici de anticorpi împotriva unor imunogeni specifici. În schimb, tehnologia de afișare fagică poate prezenta o întreagă bibliotecă de anticorpi derivată din diverse specii imune.

Tehnologia de afișare a fagilor are o gamă largă de aplicații, inclusiv screening-ul receptorilor microorganismelor patogene, studierea interacțiunilor proteinelor, urmărirea transmiterii semnalelor între celule, diagnosticarea bolilor animale și dezvoltarea de vaccinuri, printre alte domenii.

Tehnologia de afișare fagică oferă numeroase avantaje și poate fi aplicată în diverse domenii. Cu toate acestea, principala provocare în dezvoltarea anticorpilor recombinanți folosind metoda de afișare fagică este complexitatea și costul asociate procesului. Această abordare necesită integrarea tehnicilor de biologie moleculară, inclusiv mutația, clonarea și exprimarea, împreună cu analize imunologice, biochimice și biofizice pentru a identifica și caracteriza anticorpii doriți.

Prezentarea antigenului este o verigă foarte importantă. Metodele de prezentare a antigenului includ în principal prezentarea antigenului direct acoperit, prezentarea antigenului indirect acoperit, prezentarea antigenului prin screening celular întreg, prezentarea antigenului prin lipozomi, discuri nano-fosfolipidice și VLP-uri.

Metoda de acoperire directă este relativ simplă, dar conformația antigenului este ușor de modificat, iar operațiunea de acoperire indirectă este complicată, dar poate menține conformația antigenului și poate îmbunătăți eficiența prezentării. Screening-ul celular poate simula scena reală in vivo, dar există o problemă a legării nespecifice. Discul nano-fosfolipidic are dimensiuni mici, eficiență ridicată de livrare și stabilitate bună; VLP-urile sunt fuzionate cu antigen sau înfășurate cu antigen, ceea ce are imunogenitate ridicată și siguranță bună și poate declanșa un răspuns imun puternic.

Dacă concentrația este prea mică, probabilitatea de legare cu fagul va scădea, rezultând o eficiență redusă a screening-ului. În schimb, o concentrație excesiv de mare poate crește probabilitatea legării nespecifice, poate crește semnalul de fond și poate împiedica identificarea clonelor pozitive.

Se poate adopta o metodă de fixare ușoară pentru a evita temperaturile ridicate, acidul puternic și alcalii. Metoda de acoperire indirectă și sistemul biotină-streptavidină au fost utilizate pentru a reduce deteriorarea structurii antigenului. Dacă antigenul este o proteină membranară, acesta poate fi afișat pe suprafața celulelor intacte sau utilizat pentru a simula mediul membranar, cum ar fi nano-discul, pentru a-i menține conformația naturală a proteinei membranare.

Pe lângă experimentele de rutină, cum ar fi ELISA, Western Blotting (WB) și imunofluorescența (IF), se pot utiliza tehnici de detecție prin rezonanță plasmonică de suprafață (SPR) și interferometrie bio-strat (BLI) pentru a monitoriza procesele de legare și disociere ale anticorpilor și antigenelor în timp real, permițând determinarea afinității și a parametrilor cinetici.

Evidențierea fagică poate fi utilizată pentru a genera anticorpi monoclonali cu afinitate ridicată pentru o gamă largă de specii producătoare de anticorpi, inclusiv, dar fără a se limita la, oameni, șoareci, șobolani, iepuri, găini, cămile, alpaca, vaci, câini, oi, maimuțe și rechini.

Tehnologia de construire a bibliotecilor de anticorpi de șoarece este bine stabilită, rentabilă și are o durată experimentală scurtă, ceea ce o face potrivită pentru screening-ul preliminar al anticorpilor și cercetarea fundamentală. Anticorpii de iepure prezintă o afinitate și specificitate puternică, cu o gamă mai largă de recunoaștere a epitopilor în comparație cu anticorpii de șoarece. Anticorpii umani pot fi obținuți direct din bibliotecile de anticorpi umani, evitând astfel potențialele reacții imune care pot apărea atunci când anticorpii heterologi sunt administrați organismului uman. Această abordare are o valoare semnificativă în cercetarea și dezvoltarea medicamentelor, în special în crearea de anticorpi terapeutici.

Imunogenele animale sunt în general împărțite în antigen proteic, antigen polipeptidic, antigen de acid nucleic și antigen legat de agentul patogen, printre care antigenul legat de agentul patogen include antigenul viral (particulă virală completă, proteină virală, proteină nestructurală virală etc.), antigenul bacterian (extract bacterian complet, componentă a peretelui celular, proteină secretată, toxină etc.) și antigenul parazitar.

Ajustați imunogenii prin substituirea antigenelor imune cu proteine ​​recombinante și înlocuirea particulelor virale de stingere a incendiilor cu proteinele structurale ale virusurilor. Ajustați designul experimental și modificați dozajul imun.

Imunogenitatea poate fi îmbunătățită prin cuplarea antigenelor cu proteine ​​purtătoare, cum ar fi albumina serică bovină. În plus, adjuvanții imuni, inclusiv adjuvantul Freund și adjuvantul de aluminiu, pot fi utilizați pentru a prelungi timpul de rezidență in vivo și a stimula activarea și proliferarea celulelor imune, îmbunătățind astfel imunogenitatea.

O bibliotecă de anticorpi fagici este o colecție de anticorpi fagici diverși, creați prin asamblarea unui set complet de gene ale regiunii variabile din anticorpi în vectori fagici și exprimarea lor pe suprafețele fagilor. Acest proces are ca rezultat formarea unei biblioteci de anticorpi fagici.

Procesul general de afișare a fagilor implică mai mulți pași cheie: extragerea celulelor mononucleare din sângele periferic (PBMC) de la animale imunizate, izolarea ARN-ului total și transcrierea acestuia în ADN complementar (ADNc), amplificarea genei țintă folosind tehnologia reacției în lanț a polimerazei (PCR), clonarea genei țintă într-un vector fagic și transformarea vectorului într-o celulă gazdă pentru exprimare. Acest proces are ca rezultat construirea unei biblioteci de afișare a fagilor, care poate identifica rapid anticorpii cu afinitate ridicată. Ulterior, această bibliotecă poate servi drept o resursă valoroasă pentru dezvoltarea de vaccinuri, medicamente terapeutice și reactivi de diagnostic.

Conform sursei bibliotecii de anticorpi, bibliotecile de anticorpi fagici pot fi clasificate în biblioteci de anticorpi fagici imuni și biblioteci de anticorpi fagici nativi. Principala distincție dintre aceste două tipuri constă în faptul dacă animalele au fost vaccinate. În plus, bibliotecile de anticorpi nativi pot fi generate prin semi-sinteză sau sinteză.

Există doi indici principali pentru evaluarea calității unei biblioteci de anticorpi: capacitatea de stocare și diversitatea. O capacitate mare de stocare, combinată cu o diversitate ridicată, asigură screening-ul eficient al anticorpilor cu afinitate și specificitate ridicate.

În procesul de eluție biologică, biblioteca de afișare este incubată cu ținte fixe și apoi spălată extensiv pentru a îndepărta fagii nereactivi. Conjugatele sunt de obicei eluate folosind o soluție acidă sau cu conținut ridicat de sare și ulterior amplificate în celule gazdă adecvate pentru îmbogățire. După 3 până la 5 runde de screening, se obțin anticorpi cu afinitate ridicată.

Metodele de screening pentru fagi includ în principal panning-ul în fază solidă, screening-ul în fază lichidă și screening-ul bazat pe celule. Selectarea unei metode de screening adecvate ar trebui să ia în considerare caracteristicile moleculelor țintă, obiectivele procesului de screening și mediul de laborator.

Screeningul pozitiv este cea mai fundamentală metodă de screening a anticorpilor fagici care se leagă de proteinele țintă. Screeningul negativ servește la eliminarea anticorpilor nespecifici. În timpul procesului de screening al anticorpilor fagici, pot fi identificați anticorpi nespecifici din cauza interferenței cu marcajul antigenului țintă, materiale sau alți antigeni cu similarități structurale cu antigenul țintă. În astfel de cazuri, screeningul negativ poate spori eficiența procesului de screening.

Metodele de verificare a anticorpilor includ de obicei ELISA, Western Blotting (WB), citometrie în flux, imunoprecipitare (IP), imunofluorescență (IF), imunohistochimie și diverse alte tehnici experimentale. Alpha Lifetech are o vastă experiență în detectarea anticorpilor și are o echipă experimentală profesionistă, asigurând eficacitatea anticorpilor în experimentele ulterioare.