Платформа для измерения симпатий

Компания Alpha Lifetech, используя платформы Octet и Biacore-T2000, может предоставлять надежные услуги по определению аффинности. Мы можем проводить определение аффинности для различных образцов, таких как антитела, клетки, белки, малые молекулы и т. д. Существуют различные методы определения аффинности, включая метод поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и метод биослойной интерференции (BLI).

Компания Alpha Lifetech предлагает профессиональную и точную платформу для определения аффинности, которая сочетает в себе ИФА (иммуноферментный анализ) и определение аффинности, обеспечивая профессиональные, эффективные, быстрые и точные результаты определения аффинности для клиентов по всему миру. Мы предлагаем клиентам на выбор два метода: быстрое определение аффинности и точное определение аффинности. Быстрое определение аффинности — это определение аффинности для одной концентрации, в то время как точное определение аффинности позволяет измерять аффинность для различных концентраций. Эта платформа применяется для изучения взаимодействий между различными низкомолекулярными соединениями, пептидами, белками, олигонуклеотидами и олигомерами, а также липидами, бактериофагами, вирусами и клетками. Платформа для измерения аффинности может заложить основу для тестирования и скрининга аффинности лекарственных препаратов, открытия антител и облегчить последующие исследования.

Введение в сродство связывания

Аффинность важна при оценке межмолекулярных взаимодействий, в анализах аффинности лекарственных препаратов и при скрининге лекарств. Межмолекулярные взаимодействия можно описать уравнениями: L + R = LR, где L представляет свободные лиганды, R представляет несвязанные рецепторы, а LR представляет связанные комплексы лиганд-рецептор. Реакции связывания определяют межмолекулярные взаимодействия, где во время реакции происходит динамический обмен между связанным и несвязанным состояниями до достижения равновесия. Это можно описать двумя константами скорости реакции: Kon (константа скорости связывания) и Koff (константа скорости диссоциации). Значение Kd, которое является обратной величиной константы связывания (Ka), равно Koff/Kon, важной константе для аффинности реакции. Следовательно, чем прочнее связывание между двумя молекулами, тем выше аффинность. Чем меньше значение Kd, тем выше аффинность. Это уравнение можно представить в виде S-образной кривой на полулогарифмическом графике, где по оси x отложена концентрация лиганда (по логарифмической шкале), а по оси y — граничная концентрация. Пунктирная линия представляет концентрацию лиганда при Kd (1 нМ), равной 0,5 доли связывания.

Рис. 1: Сигмоидальная кривая связывания лиганда с рецептором на поверхности клетки при различных концентрациях. (Источник: Хантер С.А., Кохран Дж.Р. Методы определения аффинности белково-белковых взаимодействий с помощью анализа связывания клеток: технологии и соображения.)

Методы определения аффинности

ИФА-анализ связывающей аффинности

Широко используемая методика изучения аффинности антител основана на методе ИФА (иммуноферментного анализа), который характеризуется удобством, скоростью, простотой, высокой чувствительностью и сильной специфичностью. Он позволяет использовать небольшое количество реагентов (т. е. антител и антигенов) и измерять аффинность антител без необходимости использования реагентов для очистки. Путем иммобилизации антигена на твердой поверхности и его обнаружения с помощью первичного антитела, меченое вторичное антитело реагирует с первичным антителом, после чего данные считываются и анализируются в ридере для иммуноферментного анализа (ИФА).

Рис. 2: Методы, аналогичные ИФА, для оценки связывания разработанных пептидов с их мишенями. (Источник: Хаджикаримлу, Марьям и др., 2022. Вычислительный подход к быстрому проектированию пептидов, обнаруживающих поверхностный белок S вируса SARS-CoV-2.)

Анализ сродства связывания методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

Технология поверхностного плазмонного резонанса (SPR) в основном используется для обнаружения изменений показателя преломления. С помощью традиционных оптических явлений и резонансного явления света можно создать технологию биосенсорного анализа взаимодействия между биомолекулами, позволяющую обнаруживать взаимодействие лигандов и аналитов на биосенсорных чипах. Специфические сигналы связывания и взаимодействия между биомолекулами можно получить путем мониторинга динамических изменений углов SPR во время биологических реакций.

Рис. 3: Анализ связывания H10/AGR2 методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR). (Источник: Гарри, Каролина и др., 2018. Идентификация, характеристика и применение нового пептида против гомолога переднего градиента 2 (AGR2).)

Анализ связывающей способности с использованием биослойной интерференции (BLI)

Технология интерференции биопленки — это безмаркерный оптический метод обнаружения, позволяющий в режиме реального времени отслеживать изменения толщины биопленки на образце. Эта технология использует биосенсор на основе зонда для непосредственного обнаружения изменений толщины биопленки. Путем регистрации изменений смещения в спектре интерференции определяются связывание и диссоциация биомолекул, взаимодействующих на поверхности сенсора, и отображается смещение в реальном времени (в нм) в спектре интерференции.

Рис. 4: Биослойная интерферометрия (БЛИ) при взаимодействии aLDRG с хитинолигосахаридами. (Источник: Ли, Бин, 2023. Характерные признаки сравнительного транскриптома ризоморфов и гиф Armillaria sp. 541, участвующих в грибковом симбиозе, с акцентом на домены LysM.)

Сравнение технологий BLI и SPR

Название технологии	БЛИ (биослойная интерферометрия)	SPR (поверхностный плазмонный резонанс)
Принцип	Измеряет изменения в интерференционной картине отраженного света на поверхности датчика, обнаруживая молекулярные взаимодействия посредством изменений оптической толщины в биослое. Обеспечивает кривую связывания в реальном времени (прямое измерение).	Измеряет молекулярные взаимодействия путем обнаружения изменений показателя преломления вблизи поверхности сенсорного чипа (это происходит, когда свет взаимодействует с границей раздела золота и стекла, вызывая изменения показателя преломления). Данные отражаются как изменения резонансного угла (косвенное измерение).
Производитель	Сарториус	GE
Инструмент	Биосенсоры ForteBio	Открытый прибор SPR
Система	Система ForteBio Octet (для анализа молекулярных взаимодействий)	TraceDrawer (разработан компанией Ridgeview Instruments, Швеция)
Преимущества	1. Широкая совместимость с образцами, превосходная стабильность, особенно для обнаружения малых молекул (требования к чистоте образца и буферным условиям менее строгие). Чипы SSA экономически выгодны для исследований связывания. 2. Более высокая производительность и более короткое время проведения экспериментов по сравнению с SPR.	1. Более длительная история разработки, обеспечивающая более высокую чувствительность по сравнению с BLI. 2. Повышенная точность и надежность для конкретных применений, таких как обнаружение редких или ценных белков с более высокой аффинностью и специфичностью.
Недостатки	1. Точность данных несколько ниже по сравнению с SPR. 2. Требует тщательного обслуживания прибора. 3. Стоимость чипа SSA относительно высока.	1. Буферные условия для обнаружения очень малых молекул могут быть сложными, что увеличивает риск неудачного обнаружения. 2. Микросхемы, как правило, дороже тех, которые используются в BLI. 3. Испарение образцов во время длительных экспериментов может стать проблемой.
Тип микросхемы	Чип SSA	Чип NTA

Область применения измерения сродства

Определение аффинности может включать взаимодействие антиген-антитело (сильное взаимодействие антиген-антитело, слабое взаимодействие антиген-антитело), белок-белок, белок-пептид, белок-малая молекула и белок-ДНК/РНК (аптамер). При измерении KD необходимо знать одну из молярных концентраций. При связывании малых молекул молекулярная масса не может быть меньше 150 дальтон.

Тип	Объем	Меры предосторожности
1. Антиген-антитело	от 10^-6 до 10^-12	Значения константы диссоциации (Kd) большинства антител находятся в диапазоне от 10⁻⁶ до 10⁻⁹. Принято считать, что для высокоаффинных антител эти значения находятся в пределах 10⁻⁹, а для высокоаффинных антител — в пределах 10⁻¹².
2. Белки - малые молекулы	от 10^-4 до 10^-5	Значение KD для малых молекул и белков находится в диапазоне от 10^-4 до 10^-5, тогда как значения от 10^-3 до 10^-7 являются нормальными и не могут достигать 10^-10. Ковалентные малые молекулы могут достигать значений 10⁻¹⁰.
3. Авидин-биотин	10^-14	Аффинные соединения легко подвергаются неспецифическому связыванию, и для этого можно использовать стрептавидин или дегликозилированные аффинные соединения.
4. ДНК-белок	от 10^-8 до 10^-10	Высококачественная и полная ДНК; необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать влияния электрофореза.

Пример требований к определению аффинности

Образец	Требования
1. Образец крупной молекулы	Белок > 50 мкг, антитело > 100 мкг, биотинилированный белок > 200 мкг; белок без биотина > 2 мг, требование к чистоте > 90%, буферный раствор: PBS, HEPBS. Не должен содержать имидазольных групп; требуется контроль качества.
2. Образец малых молекул	Количество > 1 мг, порошок или жидкость; жидкость должна быть растворима в воде или ДМСО. Старайтесь не содержать глицерин, имидазол, трегалозу или другие соли; избегайте реагентов с аминогруппами, таких как Трис в буфере, обычно PBS, HEPPS и т. д., без органических реагентов.

Преимущества платформы для измерения сродства

Многовыборочный анализ

Компания Alpha Lifetech может проводить аффинные анализы для различных образцов, включая антитела, клетки, белки и другие биомолекулы.

Зрелая технологическая платформа

Мы используем передовые технологии, такие как анализ связывания SPR, анализ связывания BLI и анализ связывания ELISA.

Гибкий выбор проектов

Клиенты могут выбирать между быстрым и точным определением сродства.

Результаты высокой точности

Наша профессиональная техническая команда может гарантировать эффективные, точные и надежные результаты определения аффинности.

Пример из практикиСЛУЧАЙ

BLI экспресс-анализ аффинности антител и аптамеров анализ аффинности

Захватите биотинилированные аптамеры со специфичностью к зонду SA и растворите их. Растворите и разбавьте образец до фиксированной концентрации, затвердите захваченные аптамеры Target 1-5, специфичные к зонду, и после насыщения сигнала свяжите их с образцом. Затем добавьте их в 96-луночный планшет.

Рис. 5: Распределение позиций обнаружения для образцов в 96-луночном планшете. B обозначает буфер, используемый для балансировки и диссоциации сенсоров. L: Аптамеры Biotin Target 1-5, 221: Образец.

Обратите внимание на процесс бурения, чтобы обеспечить стабильность и точность данных, и настройте соответствующую программу для получения результатов:

Рис. 6: Диаграмма соответствия взаимодействия между аптамерами Целей 1, 2 и 3 и образцами. (CH 1 \ 3 \ 5 представляет собой сигнал и данные взаимодействия между затвердевшим зондом из аптамеров Целей 1 \ 2 \ 3 и образцом.)

Рис. 7: Диаграмма соответствия взаимодействия между аптамерами Целей 4 и 5 и образцами. (CH 1 \ 3 представляет собой сигнал и данные взаимодействия между затвердевшим зондом-аптамером Целей 4 \ 5 и образцом.)

результаты показывают

Были получены следующие результаты: сродство адаптера Target 1 к образцу после подгонки составило 9,41 ^ -8; сродство адаптера Target 2 к образцу после подгонки — 8,32 ^ -8; сродство адаптера Target 3 к образцу после подгонки — 8,64 ^ -8; сродство адаптера Target 4 к образцу после подгонки — 3,70 ^ -8; сродство адаптера Target 5 к образцу после подгонки — 3,01 ^ -8.

Если у вас возникнут какие-либо вопросы, пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к нам в любое время.