Платформа измерения близости

На основе Octet и платформы Biacore-T2000 Alpha Lifetech может предоставлять надежные услуги по определению аффинности. Мы можем предоставлять определение аффинности для нескольких образцов, таких как антитела, клетки, белки, малые молекулы и т. д. Существуют различные методы определения аффинности, включая определение аффинности с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и интерференции биослоя (BLI).

Alpha Lifetech имеет профессиональную и точную платформу определения аффинности, которая объединяет ИФА с определением аффинности, обеспечивая профессиональные, эффективные, быстрые и точные результаты определения аффинности для клиентов по всему миру. Мы можем предложить клиентам на выбор два метода: быстрое определение аффинности и точное определение аффинности. Быстрое определение аффинности представляет собой определение одной концентрации, в то время как точное определение аффинности может измерять аффинность различных концентраций. Применяется для изучения взаимодействий между различными низкомолекулярными соединениями, пептидами, белками, олигонуклеотидами и олигомерами, а также липидами, бактериофагами, вирусами и клетками. Платформа измерения аффинности может заложить основу для тестирования и скрининга аффинных препаратов, обнаружения антител и облегчить последующие исследования.

Введение в сродство связывания

Сродство важно для оценки межмолекулярных взаимодействий, анализов сродства лекарственных средств и скрининга лекарственных средств. Межмолекулярные взаимодействия можно описать уравнениями: L + R = LR, где L представляет свободные лиганды, R представляет несвязанные рецепторы, а LR представляет связанные комплексы лиганд-рецептор. Реакции связывания определяют межмолекулярные взаимодействия, где динамический обмен происходит между связанными и несвязанными состояниями во время реакции до достижения равновесия. Это можно описать двумя константами скорости, Kon (константа скорости связывания) и Koff (константа скорости диссоциации) реакции. Значение Kd, которое является обратной величиной константы связывания (Ka), равно Koff/Kon, важной константе для сродства реакции. Следовательно, чем сильнее связь между двумя молекулами, тем выше сродство. Чем меньше значение Kd, тем наоборот. Это уравнение можно представить в виде S-образной кривой на полулогарифмическом графике с концентрацией лиганда на оси x (на оси логарифмической шкалы) и границей дроби на оси y. Пунктирная линия представляет концентрацию лиганда при Kd (1 нМ) фракции связывания 0,5.

Рис. 1: Сигмоидальная кривая связывания различных концентраций лиганда, связанного с рецептором клеточной поверхности. (Источник ссылки:Хантер С.А., Кочран Дж.Р. Анализы связывания клеток для определения сродства белок-белковых взаимодействий: технологии и соображения.)

Методы определения сродства

Анализ связывающей аффинности ELISA

Широко используемый метод изучения аффинности антител основан на методе ELISA, который характеризуется удобством, скоростью, простотой, высокой чувствительностью и сильной специфичностью. Он может использовать небольшое количество реагентов (т. е. антител и антигенов) и измерять аффинность антител без необходимости в реагентах для очистки. Иммобилизуя антиген на твердой поверхности и обнаруживая его с помощью первичного антитела, меченое вторичное антитело реагирует с первичным антителом для считывания и анализа данных в ридере иммуноферментного анализа (ELISA).

Рис. 2: Анализы, подобные ИФА, для оценки связывания разработанных пептидов с их мишенями. (Источник ссылки:Хаджикаримлу, Марьям и др., 2022. Вычислительный подход к быстрому проектированию пептидов, обнаруживающих поверхностный белок S SARS-CoV-2.)

Анализ связывающей аффинности с помощью поверхностного плазмонного резонанса (ППР)

Технология SPR в основном обнаруживает изменения показателя преломления. С помощью традиционных оптических явлений и явления резонанса света можно построить технологию анализа биосенсорного взаимодействия между биомолекулами для обнаружения взаимодействия между лигандами и аналитами на биосенсорных чипах. Конкретные сигналы связывания и взаимодействия между биомолекулами можно получить, отслеживая динамические изменения углов SPR во время биологических реакций.

Рис. 3: Анализ поверхностного плазмонного резонанса (ППР) связывания H10/AGR2. (Источник ссылки:Гарри, Каролина и др., 2018. Идентификация, характеристика и применение нового пептида против гомолога переднего градиента 2 (AGR2).)

Анализ связывающей аффинности Bio Layer Interference (BLI)

Технология интерференции биопленки — это метод оптического обнаружения без меток, мониторинг в реальном времени, который в основном используется для всестороннего количественного анализа межмолекулярных взаимодействий и определения концентрации белка. Эта технология использует зондовый биосенсор для непосредственного обнаружения изменений толщины биопленки на образце. Путем обнаружения изменений смещения спектра интерференции обнаруживается связывание и диссоциация между биомолекулами, взаимодействующими на поверхности датчика, и отображается смещение (нм) спектра интерференции в реальном времени.

Рис. 4: Анализ интерферометрии биослоя (BLI) между aLDRG и хитинолигосахаридами. (Источник ссылки:Ли, Бин, 2023. Отличительные признаки сравнительной транскриптомы между ризоморфами и гифами Armillaria sp. 541, участвующих в грибковом симбиозе с акцентом на домены LysM.)

Сравнение технологий BLI и SPR

Название технологии	BLI (биослойная интерферометрия)	SPR (поверхностный плазмонный резонанс)
Принцип	Измеряет изменения в интерференционной картине отраженного света на поверхности сенсора, обнаруживая молекулярные взаимодействия через изменения оптической толщины на биослое. Предоставляет кривую связывания в реальном времени (прямое измерение).	Измеряет молекулярные взаимодействия, обнаруживая изменения сигнала в показателе преломления вблизи поверхности сенсорного чипа (происходит, когда свет взаимодействует с интерфейсом золота и стекла, вызывая изменения показателя преломления). Данные отражаются как изменения в угле резонанса (косвенное измерение).
Производитель	Сарториус	ГЭ
Инструмент	Биосенсоры ForteBio	Открытый SPR-инструмент
Система	Система ForteBio Octet (для анализа молекулярных взаимодействий)	TraceDrawer (разработано Ridgeview Instruments, Швеция)
Преимущества	1. Широкая совместимость с образцами, отличная стабильность, особенно для обнаружения малых молекул (специфические требования к чистоте образца и буферным условиям менее строгие). Чипы SSA экономически эффективны для исследований связывания. 2. Более высокая производительность и более короткое время эксперимента по сравнению с SPR.	1. Более длительная история разработки, обеспечивающая более высокую чувствительность по сравнению с BLI. 2. Более высокая точность и надежность для конкретных приложений, таких как обнаружение редких или ценных белков с более высокими данными о сродстве и специфичности.
Недостатки	1. Точность данных немного ниже по сравнению с SPR. 2. Требует тщательного ухода за прибором. 3. Стоимость чипа SSA относительно высока.	1. Буферные условия для обнаружения очень малых молекул могут быть сложными, что увеличивает риск неудачного обнаружения. 2. Чипы, как правило, дороже тех, что используются в BLI. 3. Испарение образца во время длительных экспериментов может стать проблемой.
Тип чипа	Чип SSA	Чип NTA

Область измерения близости

Определение аффинности может включать антиген-антитело (сильный антиген-антитело, слабый антиген-антитело), белок-белок, белок-пептид, белок-малая молекула и белок ДНК/РНК (аптамер). При измерении KD необходимо знать одну из молярных концентраций. При связывании малых молекул одна молекулярная масса не может быть меньше 150 дальтон.

Тип	Объем	Меры предосторожности
1. Антиген-Антитело	10^-6 до 10^-12	Значения Kd большинства антител находятся в диапазоне от 10^-6-10^-7 до 10^-9. Обычно считается, что высокоаффинные антитела находятся в пределах 10^-9, а высокоаффинные. Антитела находятся в пределах 10^-12.
2. Белок - Малые молекулы	10^-4 до 10^-5	KD малых молекул и белков составляет от 10^-4 до 10^-5, тогда как 10^-3 и 10^-7 являются нормальными и не могут достигать 10^-10. Ковалентные малые молекулы могут достигать 10^-10.
3. Авидин-Биотин	10^-14	Аффинность может легко подвергаться неспецифическому связыванию, и можно использовать стрептавидиновую или дегликозилированную аффинность.
4. ДНК-Белок	10^-8 до 10^-10	Высококачественная и полная ДНК; будьте осторожны, чтобы не допустить влияния электрофореза.

Требования к образцам для определения сродства

Образец	Требования
1. Образец большой молекулы	Белок > 50 мкг, антитело > 100 мкг, биотинилированный белок > 200 мкг; белок без биотина > 2 мг, требования к чистоте > 90%, буферный раствор: PBS, HEPBS. Не может содержать имидазольных групп; требуется контроль качества.
2. Образец малой молекулы	Количество>1 мг, порошок или жидкость, жидкость должна быть растворима в воде или ДМСО. Постарайтесь не содержать глицерин, имидазол, трегалозу или другие соли; старайтесь избегать реагентов с аминогруппами, такими как Трис в буфере, как правило, PBS, HEPPS и т. д. без органических реагентов.

Преимущества платформы измерения близости

Анализ множественных образцов

Alpha Lifetech может предоставить анализы аффинности для различных образцов, включая антитела, клетки, белки и другие биомолекулы.

Зрелая технологическая платформа

У нас есть передовые технологии, такие как анализ связывания spr, анализ связывания bli и анализ связывания elisa.

Гибкий выбор проекта

Клиенты могут выбирать между быстрым определением сродства и точным определением сродства.

Высокоточные результаты

Наша профессиональная техническая команда может гарантировать эффективные, точные и надежные результаты определения сродства.

Исследование случаяСЛУЧАЙ

BLI быстрый аффинный анализ антител и аптамеров аффинный анализ

Захватите биотинилированные аптамеры с зондом SA специфичностью и растворите их. Растворите и разбавьте образец до фиксированной концентрации, затвердите захваченные аптамеры Target 1-5, специфичные для зонда, и после насыщения сигнала свяжите с образцом. Затем добавьте их в 96-луночный планшет.

Рис. 5: Распределение позиций обнаружения для образцов 96-луночного планшета. B относится к буферу, который используется для балансировки и диссоциации сенсоров. L: Аптамеры биотиновой мишени 1-5, 221: Образец.

Обратите внимание на сверление, чтобы обеспечить стабильность и точность данных, и установите соответствующую программу для получения результатов:

Рис. 6: Диаграмма подгонки взаимодействия между аптамерами Target 1, 2 и 3 и образцами. (CH 1 \ 3 \ 5 представляет сигнал и данные взаимодействия между затвердевшим зондом аптамеров Target 1 \ 2 \ 3 и образцом.)

Рис. 7: Диаграмма подгонки взаимодействия между аптамерами Target 4 и 5 и образцами. (CH 1 \ 3 представляет сигнал и данные взаимодействия между затвердевшим зондом аптамера Target 4 \ 5 и образцом.)

результаты показывают

Были получены следующие результаты: сродство адаптера Target 1 к образцу после подгонки составило 9,41^-8; сродство адаптера Target 2 к образцу после подгонки составило 8,32^-8; сродство адаптера Target 3 к образцу после подгонки составило 8,64^-8; сродство адаптера Target 4 к образцу после подгонки составило 3,70^-8; сродство адаптера Target 5 к образцу после подгонки составило 3,01^-8.

Если у вас возникнут какие-либо вопросы, пожалуйста, обращайтесь к нам в любое время.