Услуга по созреванию аффинности антител

Alpha Lifetech Inc.Мы предлагаем услуги по аффинной дозреванию антител с использованием технологий мутации и селекции. В процессе аффинной дозревания мы обычно используем scFv в качестве формата антител, а также моновалентную систему фагемидов, которая применяется для снижения влияния аффинности на скрининг связывания антигенов. Наша команда профессионалов также может предоставлять услуги по аффинной дозреванию однодоменных антител.

Alpha Lifetech Inc.Мы гордимся тем, что предлагаем комплексные услуги для удовлетворения разнообразных потребностей клиентов по всему миру. Наша цель — понимать и удовлетворять запросы различных клиентов, а также оказывать помощь в решении любых возникающих проблем в научно-исследовательской работе.

Что такое созревание аффинности?

Созревание аффинности — это процесс, в ходе которого антитела подвергаются многократным мутациям и селекции для повышения их аффинности к специфическим антигенам. В основном происходящий в герминативных центрах вторичных лимфоидных органов, B-клетки подвергаются соматической гипермутации и селекции под влиянием T-клеток и фолликулярных дендритных клеток.
В процессе созревания аффинности В-клетки с низкоаффинными поверхностными рецепторами иммуноглобулинов активируются при контакте с антигеном и подвергаются пролиферации и дифференцировке. В результате соматической гипермутации происходит созревание аффинности, в вариабельном регионе генов иммуноглобулинов происходят случайные нуклеотидные замены, что приводит к образованию различных вариантов антител. После соматической гипермутации проводится антиген-зависимая селекция В-клеток с мутированными рецепторами иммуноглобулинов. В-клетки, продуцирующие антитела с повышенной антигенной аффинностью, преимущественно сохраняются и получают возможность пролиферировать, в то время как В-клетки с пониженной или неизмененной аффинностью подвергаются апоптозу. Этот итеративный процесс мутации и селекции приводит к образованию клонов В-клеток, продуцирующих антитела с постепенно возрастающей аффинностью к антигену.

Услуга по созреванию аффинности антител

Главные преимущества методов, основанных на ПЦР, заключаются в том, что мутации точно нацелены на амплифицированный фрагмент; частота ошибок легко контролируется, а сам метод быстр и прост в применении и не требует использования опасных химических веществ. Хорошо известно, что ДНК-полимераза Taq дублирует ДНК с низкой точностью, в основном из-за отсутствия корректирующей активности в направлении от 3' к 5'.Компания Alpha LifetechПлатформа для инженерии антител использует метод ПЦР с ошибками для мутации преимущественно CDR-регионов в процессе создания суббиблиотек. Часто мутации создаются в совершенно случайных позициях по всей последовательности VH и VL фрагментов, чтобы увеличить генетическое разнообразие суббиблиотеки. После создания библиотеки мутированных генов антител методом ПЦР с ошибками, отбор высокоаффинных вариантов (аффинность scFv-антител может достигать 10^8 - 10^10 М) осуществляется либо путем скрининга в растворе, либо на иммобилизованном антигене с условиями промывки, оптимизированными для отбора, зависящего от скорости диссоциации.
  
Ученые вAlpha Lifetech Inc.В качестве одной из стратегий мутации можно использовать мутантные штаммы Escherichia coli mutAD5TM для введения случайных мутаций и, таким образом, изменения аффинности и экспрессии рекомбинантных фрагментов антител. Условия селекции можно модифицировать для фрагментов антител с повышенным уровнем продукции. Условия роста в мутантных клетках Escherichia coli можно регулировать для введения одной случайной точечной мутации на килобазу ДНК, что почти эквивалентно одному изменению кодона на фрагмент scFv. После нескольких циклов мутации, экспрессии и селекции мы можем улучшить константу аффинности с 10^5 - 10^6 М до 10^8 - 10^10 М.

Улучшение стратегий созревания аффинности

Для повышения аффинности можно рандомизировать определенные позиции антител с заданным уровнем разнообразия (например, полная рандомизация всех 20 аминокислот или смещенная рандомизация отдельных аминокислот в фиксированных процентах). У нас есть две стратегии повышения аффинности антител: во-первых, мутации вводятся в ограниченные позиции в комплементарно-определяющих областях (CDR) с помощью направленного мутагенеза; во-вторых, мутации вводятся во все V-кодирующие области с помощью случайного мутагенеза. Используя эти два метода, консервативные аминокислотные последовательности или весь каркасный регион антитела будут замещены другими аминокислотами, что в сочетании с нашими технологиями сканирования пептидных библиотек может значительно повысить аффинность интересующих антител до очень высокого уровня.

Фаговый дисплей – аффинность антител

После создания библиотеки мутантов scFv доступны две стратегии скрининга: биоскрининг и сортировка твердых антигенов. В первой используется субтрактивная концентрация субстрата для выделения высокоаффинных антител, поскольку низкоаффинные мутанты будут вымыты, оставив высокоаффинные фаговые частицы. Вторая стратегия использует меченый антиген в растворе, отбор на основе константы равновесия (Kd) и отбор на основе кинетики связывания; этот подход к отбору выделяет варианты антител с улучшенной константой равновесия (Kd).

Если у вас возникнут какие-либо вопросы, пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к нам в любое время.