Служба созревания аффинности антител

Альфа Лайфтех Инк.может предложить услугу созревания аффинности антител с использованием технологий мутации и селекции. Обычно мы используем scFv в качестве формата антител в процессах службы созревания аффинности и моновалентную дисплейную фагмидную систему, которая использовалась для снижения эффектов авидности во время скрининга связывания антигена. Наша профессиональная команда может также предоставить услуги созревания аффинности для однодоменных антител.

Альфа Лайфтех Инк.с гордостью предлагает комплексные услуги для удовлетворения разнообразных потребностей клиентов по всему миру. Наша цель — понять и удовлетворить потребности разных клиентов и помочь с любыми предстоящими и возникающими проблемами в исследовательской работе.

Что такое созревание сродства?

Созревание аффинности — это процесс, при котором антитела подвергаются повторным мутациям и отбору для повышения их аффинности к определенным антигенам. В основном происходящие в зародышевых центрах вторичных лимфоидных органов, В-клетки подвергаются соматической гипермутации и отбору под влиянием Т-клеток и фолликулярных дендритных клеток.
В процессе созревания аффинности В-клетки с низкоаффинными поверхностными иммуноглобулиновыми рецепторами активируются при столкновении с антигеном и подвергаются пролиферации и дифференцировке. В ходе созревания аффинности соматической гипермутации случайные замены нуклеотидов происходят в вариабельной области генов иммуноглобулинов, что приводит к образованию различных вариантов антител. После соматической гипермутации на В-клетках с мутированными иммуноглобулиновыми рецепторами проводится отбор, управляемый антигеном. В-клетки, которые вырабатывают антитела с повышенным антигенным сродством, предпочтительно сохраняются и им позволяют размножаться, в то время как В-клетки с пониженным или неизменным сродством подвергаются апоптозу. Этот итеративный процесс мутации и отбора приводит к образованию клонов В-клеток, вырабатывающих антитела с постепенно более высоким сродством к антигену.

Служба созревания аффинности антител

Главные преимущества методов на основе ПЦР заключаются в том, что мутации точно нацелены на амплифицированный фрагмент; уровень ошибок легко контролировать, а метод быстр и прост в настройке и не использует опасные химикаты. Хорошо известно, что ДНК-полимераза Taq дублирует ДНК с низкой точностью, в основном из-за отсутствия корректирующей активности 3'-5'.Alpha Lifetech'sПлатформа инженерии антител применяет подверженный ошибкам подход ПЦР для мутации в основном областей CDR во время построения подбиблиотеки. И часто мы создаем мутации в совершенно случайных положениях по всем фрагментам VH и VL, чтобы увеличить генетическое разнообразие подбиблиотеки. После построения библиотеки генов мутированных антител с помощью подверженной ошибкам ПЦР, выбор вариантов с высоким сродством (сродство антител scFv может достигать 10^8 - 10^10 M) выполняется либо путем пэннинга в растворе, либо на иммобилизованном антигене с условиями промывки, оптимизированными для выбора, зависящего от скорости отсеивания.

Ученые вАльфа Лайфтех Инк.использовать штаммы Escherichia coli mutator mutAD5TM в качестве одной из нескольких стратегий мутации для введения случайных мутаций и тем самым изменять сродство и экспрессию фрагментов рекомбинантных антител. Условия отбора могут быть изменены для фрагментов антител с повышенным уровнем продукции. Условия роста в клетках Escherichia coli mutator могут быть скорректированы для введения одной случайной точечной мутации на килобазу ДНК, что почти эквивалентно одной замене кодона на фрагмент scFv. После нескольких циклов мутации, отображения и отбора мы можем улучшить константу сродства с 10^5 - 10^6 M до 10^8 - 10^10 M.

Улучшение стратегий созревания сродства

Определенные позиции антител могут быть рандомизированы с определенным разнообразием (например, полная рандомизация со всеми 20 аминокислотами или смещенная рандомизация с выбранными аминокислотами в фиксированных процентах) для улучшения сродства. У нас есть две стратегии для улучшения сродства антител: во-первых, мутации вводятся в ограниченные позиции в областях, определяющих комплементарность (CDR), с помощью направленного мутагенеза; во-вторых, мутации вводятся во все области V-кодирования с помощью случайного мутагенеза. Используя эти два метода, консервативные аминокислотные последовательности или вся каркасная область антитела будут заменены другими аминокислотами, что в сочетании с нашими технологиями сканирования пептидной библиотеки может чрезвычайно повысить сродство интересующих антител до очень высокого уровня.

Фаговый дисплей-Аффинность антител

После создания библиотеки мутантов scFv доступны две стратегии скрининга: биопэннинг и сортировка твердых антигенов. В первом случае субтрактивная концентрация субстрата используется для выделения высокоаффинного антитела, поскольку низкоаффинные мутанты будут вымыты, оставляя высокоавидные фаговые частицы. Во второй стратегии используется меченый антиген в растворе, отбор на основе константы равновесия (Kd) и отбор на основе кинетики связывания, этот подход к отбору выделяет варианты антител с улучшенным Kd.