Технология фагового дисплея заключается во введении чужеродного целевого гена в определенное место белка капсида фага и экспрессии этого гена на поверхности фага без нарушения его нормальной функции. После нескольких этапов скрининга был получен целевой белок с высокой специфичностью и высокой биологической активностью.

С помощью этой технологии можно создавать библиотеки антител большой емкости. Цикл скрининга короткий, операционный процесс простой, а спектр применения обширен, что позволяет идентифицировать оптимальные последовательности для целевых пептидов или белков. В приложениях, связанных с вирусами, исследователи могут обнаруживать антитела, связывающиеся с критически важными вирусными эпитопами, путем скрининга больших библиотек антител. Этот процесс может препятствовать проникновению, репликации или механизмам уклонения вирусов от иммунной защиты, тем самым закладывая основу для лечения заболеваний.

Технология фагового дисплея используется шире, чем гибридомная технология, которая ограничена производством небольшого количества антител против специфических иммуногенов. В отличие от нее, технология фагового дисплея позволяет представить целую библиотеку антител, полученных от различных иммунных видов.

Технология фагового дисплея имеет широкий спектр применения, включая скрининг рецепторов патогенных микроорганизмов, изучение белковых взаимодействий, отслеживание передачи сигналов между клетками, диагностику заболеваний животных и разработку вакцин, а также многие другие области.

Технология фагового дисплея обладает многочисленными преимуществами и может применяться в различных областях. Однако основной проблемой при разработке рекомбинантных антител с использованием метода фагового дисплея является сложность и стоимость этого процесса. Такой подход требует интеграции методов молекулярной биологии, включая мутацию, клонирование и экспрессию, а также иммунологического, биохимического и биофизического анализа для идентификации и характеристики желаемых антител.

Презентация антигенов является очень важным звеном. Методы презентации антигенов в основном включают прямую презентацию антигенов с покрытием, непрямую презентацию антигенов с покрытием, презентацию антигенов посредством скрининга целых клеток, презентацию антигенов с помощью липосом, нанофосфолипидных дисков и вирусных частиц (ВПЧ).

Метод прямого нанесения покрытия относительно прост, но конформация антигена легко изменяется, а непрямое нанесение покрытия сложнее, однако оно позволяет поддерживать конформацию антигена и повышать эффективность презентации. Скрининг клеток может имитировать реальную ситуацию in vivo, но существует проблема неспецифического связывания. Нанофосфолипидные диски имеют малый размер, высокую эффективность доставки и хорошую стабильность; вирусные частицы, слитые с антигеном или обернутые антигеном, обладают высокой иммуногенностью и хорошей безопасностью и могут вызывать сильный иммунный ответ.

Если концентрация слишком низкая, вероятность связывания с фагом снизится, что приведет к снижению эффективности скрининга. И наоборот, чрезмерно высокая концентрация может увеличить вероятность неспецифического связывания, повысить фоновый сигнал и затруднить идентификацию положительных клонов.

Для предотвращения воздействия высоких температур, сильных кислот и щелочей можно использовать щадящие методы фиксации. Для уменьшения повреждения структуры антигена применяются методы непрямого покрытия и система биотин-стрептавидин. Если антиген представляет собой мембранный белок, его можно разместить на поверхности неповрежденных клеток или использовать для имитации мембранной среды, например, нанодиска, чтобы сохранить его естественную конформацию мембранного белка.

В дополнение к стандартным экспериментам, таким как ИФА, вестерн-блоттинг (ВБ) и иммунофлуоресценция (ИФ), для мониторинга процессов связывания и диссоциации антител и антигенов в режиме реального времени могут использоваться методы поверхностного плазмонного резонанса (СПР) и биослойной интерферометрии (БЛИ), позволяющие определять параметры сродства и кинетики.

Фаговое дисплейное исследование может быть использовано для получения высокоаффинных моноклональных антител к широкому спектру видов, продуцирующих антитела, включая, помимо прочих, людей, мышей, крыс, кроликов, кур, верблюдов, альпак, коров, собак, овец, обезьян и акул.

Технология создания библиотек мышиных антител хорошо отработана, экономически эффективна и имеет короткий экспериментальный период, что делает ее подходящей для предварительного скрининга антител и фундаментальных исследований. Кроличьи антитела обладают высокой аффинностью и специфичностью, а также более широким диапазоном распознавания эпитопов по сравнению с мышиными антителами. Человеческие антитела могут быть получены непосредственно из библиотек человеческих антител, что позволяет избежать потенциальных иммунных реакций, которые могут возникнуть при введении гетерологичных антител в организм человека. Этот подход имеет большое значение в исследованиях и разработках лекарственных препаратов, особенно в создании терапевтических антител.

Иммуногены животных обычно делятся на белковые антигены, полипептидные антигены, нуклеиновые кислоты и антигены, связанные с патогенами, среди которых антигены, связанные с патогенами, включают вирусные антигены (полные вирусные частицы, вирусные белки, неструктурные белки вирусов и др.), бактериальные антигены (полный бактериальный экстракт, компоненты клеточной стенки, секретируемые белки, токсины и др.) и паразитарные антигены.

Корректировка иммуногенов путем замены иммунных антигенов рекомбинантными белками и замены вирусных частиц, используемых для тушения пожаров, структурными белками вирусов. Корректировка экспериментальной схемы и изменение дозы иммунизации.

Иммуногенность может быть повышена за счет связывания антигенов с белками-носителями, такими как бычий сывороточный альбумин. Кроме того, для увеличения времени пребывания в организме и стимуляции активации и пролиферации иммунных клеток, что повышает иммуногенность, можно использовать иммунные адъюванты, включая адъювант Фрейнда и алюминиевый адъювант.

Библиотека фаговых антител — это коллекция разнообразных фаговых антител, созданная путем сборки полного набора генов вариабельных областей антител в фаговые векторы и их экспрессии на поверхности фагов. В результате этого процесса формируется библиотека фаговых антител.

Общий процесс фагового дисплея включает несколько ключевых этапов: выделение мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) из иммунизированных животных, выделение общей РНК и ее транскрипция в комплементарную ДНК (кДНК), амплификация целевого гена с использованием технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР), клонирование целевого гена в фаговый вектор и трансформация вектора в клетку-хозяина для экспрессии. В результате этого процесса создается библиотека фагового дисплея, которая позволяет быстро идентифицировать высокоаффинные антитела. Впоследствии эта библиотека может служить ценным ресурсом для разработки вакцин, терапевтических препаратов и диагностических реагентов.

В зависимости от источника библиотеки антител, фаговые библиотеки антител можно разделить на иммунные фаговые библиотеки антител и нативные фаговые библиотеки антител. Основное различие между этими двумя типами заключается в том, были ли животные вакцинированы. Кроме того, нативные библиотеки антител могут быть получены с помощью полусинтеза или синтеза.

Для оценки качества библиотеки антител используются два основных показателя: емкость хранилища и разнообразие. Большая емкость хранилища в сочетании с высоким разнообразием обеспечивает эффективный скрининг антител с высокой аффинностью и специфичностью.

В процессе биологической элютриации библиотека белков инкубируется с фиксированными мишенями, а затем тщательно промывается для удаления нереактивных фагов. Конъюгаты обычно элюируются с использованием кислого или высокосолевого раствора, а затем амплифицируются в подходящих клетках-хозяевах для обогащения. После 3-5 раундов скрининга получают антитела с высокой аффинностью.

К основным методам скрининга фагов относятся твердофазный отбор, жидкофазный скрининг и клеточный скрининг. При выборе подходящего метода скрининга следует учитывать характеристики целевых молекул, цели процесса скрининга и лабораторные условия.

Положительный скрининг — это наиболее фундаментальный метод скрининга антител к фагам, связывающихся с целевыми белками. Отрицательный скрининг служит для исключения неспецифических антител. В процессе скрининга антител к фагам могут быть выявлены неспецифические антитела из-за помех со стороны метки целевого антигена, материалов или других антигенов, имеющих структурное сходство с целевым антигеном. В таких случаях отрицательный скрининг может повысить эффективность процесса скрининга.

Методы проверки наличия антител обычно включают ИФА (иммуноферментный анализ), вестерн-блоттинг (ВБ), проточную цитометрию, иммунопреципитацию (ИП), иммунофлуоресценцию (ИФ), иммуногистохимию и различные другие экспериментальные методы. Компания Alpha Lifetech обладает обширным опытом в области обнаружения антител и имеет профессиональную экспериментальную команду, что гарантирует эффективность антител в последующих экспериментах.