Технология фагового дисплея заключается в том, чтобы вставить чужеродный целевой ген в определенное положение капсидного белка фага и экспрессировать чужеродный ген на поверхности фага, не влияя на нормальную функцию фага. После нескольких раундов скрининга был наконец получен целевой белок с высокой специфичностью и высокой биологической активностью.

С помощью этой технологии можно создавать библиотеки антител высокой емкости. Цикл скрининга короткий, рабочий процесс простой, а спектр приложений обширный, что позволяет идентифицировать оптимальные последовательности для целевых пептидов или белков. В приложениях, связанных с вирусами, исследователи могут обнаруживать антитела, которые связываются с критическими вирусными эпитопами, путем скрининга больших библиотек антител. Этот процесс может препятствовать проникновению, репликации или механизмам уклонения вирусов от иммунного ответа, тем самым создавая основу для лечения заболеваний.

Технология фагового дисплея используется шире, чем гибридомная технология, которая ограничивается производством небольшого количества антител против определенных иммуногенов. Напротив, технология фагового дисплея может представлять целую библиотеку антител, полученных из различных иммунных видов.

Технология фагового дисплея имеет широкий спектр применения, включая скрининг рецепторов патогенных микроорганизмов, изучение взаимодействия белков, отслеживание передачи сигналов между клетками, диагностику заболеваний животных и разработку вакцин, а также другие области.

Технология фагового дисплея предлагает многочисленные преимущества и может применяться в различных областях. Однако основной проблемой при разработке рекомбинантных антител с использованием метода фагового дисплея является сложность и стоимость, связанные с процессом. Этот подход требует интеграции методов молекулярной биологии, включая мутацию, клонирование и экспрессию, а также иммунологических, биохимических и биофизических анализов для идентификации и характеристики желаемых антител.

Презентация антигена является очень важным звеном. Методы презентации антигена в основном включают прямую презентацию антигена с покрытием, непрямую презентацию антигена с покрытием, презентацию антигена посредством скрининга целых клеток, презентацию антигена через липосомы, нанофосфолипидные диски и VLP.

Метод прямого покрытия относительно прост, но конформацию антигена легко изменить, а операция непрямого покрытия сложна, но она может поддерживать конформацию антигена и повышать эффективность презентации. Скрининг клеток может имитировать реальную сцену in vivo, но существует проблема неспецифического связывания. Нанофосфолипидный диск имеет небольшой размер, высокую эффективность доставки и хорошую стабильность; VLP сливаются с антигеном или оборачиваются антигеном, что имеет высокую иммуногенность и хорошую безопасность и может вызвать сильный иммунный ответ.

Если концентрация слишком низкая, вероятность связывания с фагом уменьшится, что приведет к снижению эффективности скрининга. Наоборот, чрезмерно высокая концентрация может увеличить вероятность неспецифического связывания, повысить фоновый сигнал и затруднить идентификацию положительных клонов.

Можно использовать мягкий метод фиксации, чтобы избежать высокой температуры, сильной кислоты и щелочи. Метод непрямого покрытия и система биотин-стрептавидин использовались для уменьшения повреждения структуры антигена. Если антиген является мембранным белком, его можно отображать на поверхности неповрежденных клеток или использовать для имитации мембранной среды, такой как нанодиск, для сохранения его естественной конформации мембранного белка.

В дополнение к рутинным экспериментам, таким как ИФА, вестерн-блоттинг (ВБ) и иммунофлуоресценция (ИФ), методы обнаружения поверхностного плазмонного резонанса (ППР) и бислойной интерферометрии (БЛИ) могут использоваться для мониторинга процессов связывания и диссоциации антител и антигенов в режиме реального времени, что позволяет определять параметры сродства и кинетики.

Фаговый дисплей можно использовать для получения высокоаффинных моноклональных антител для широкого спектра видов, продуцирующих антитела, включая, помимо прочего, людей, мышей, крыс, кроликов, кур, верблюдов, альпак, коров, собак, овец, обезьян и акул.

Технология создания библиотек антител мыши хорошо зарекомендовала себя, экономически эффективна и имеет короткую экспериментальную продолжительность, что делает ее пригодной для предварительного скрининга антител и фундаментальных исследований. Антитела кролика проявляют сильное сродство и специфичность с более широким диапазоном распознавания эпитопов по сравнению с антителами мыши. Человеческие антитела могут быть получены напрямую из библиотек антител человека, тем самым избегая потенциальных иммунных реакций, которые могут возникнуть при введении гетерологичных антител в организм человека. Этот подход имеет большое значение в исследовании и разработке лекарственных средств, особенно при создании терапевтических антител.

Иммуногены животных обычно делятся на белковые антигены, полипептидные антигены, антигены нуклеиновых кислот и антигены, связанные с патогенами, среди которых антигены, связанные с патогенами, включают вирусный антиген (полная вирусная частица, вирусный белок, неструктурный белок вируса и т. д.), бактериальный антиген (полный бактериальный экстракт, компонент клеточной стенки, секретируемый белок, токсин и т. д.) и паразитарный антиген.

Отрегулируйте иммуногены, заменив иммунные антигены рекомбинантными белками и заменив огнетушащие вирусные частицы структурными белками вирусов. Отрегулируйте экспериментальный дизайн и измените иммунную дозировку.

Иммуногенность может быть повышена путем связывания антигенов с белками-носителями, такими как бычий сывороточный альбумин. Кроме того, иммунные адъюванты, включая адъювант Фрейнда и алюминиевый адъювант, могут использоваться для продления времени пребывания in vivo и стимуляции активации и пролиферации иммунных клеток, тем самым улучшая иммуногенность.

Библиотека фаговых антител представляет собой коллекцию разнообразных фаговых антител, созданных путем сборки полного набора генов вариабельных областей из антител в фаговые векторы и их экспрессии на поверхности фагов. Этот процесс приводит к формированию библиотеки фаговых антител.

Общий процесс фагового дисплея включает несколько ключевых этапов: извлечение мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) из иммунизированных животных, выделение общей РНК и ее транскрипция в комплементарную ДНК (кДНК), амплификация целевого гена с использованием технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР), клонирование целевого гена в фаговый вектор и трансформация вектора в клетку-хозяина для экспрессии. Этот процесс приводит к созданию библиотеки фагового дисплея, которая может быстро идентифицировать высокоаффинные антитела. Впоследствии эта библиотека может служить ценным ресурсом для разработки вакцин, терапевтических препаратов и диагностических реагентов.

В зависимости от источника библиотеки антител библиотеки фаговых антител можно разделить на библиотеки иммунофаговых антител и библиотеки нативных фаговых антител. Основное различие между этими двумя типами заключается в том, были ли вакцинированы животные. Кроме того, библиотеки нативных антител могут быть получены путем полусинтеза или синтеза.

Существует два основных индекса для оценки качества библиотеки антител: емкость хранения и разнообразие. Большая емкость хранения в сочетании с высоким разнообразием обеспечивает эффективный скрининг антител как с высокой аффинностью, так и специфичностью.

В процессе биологической элютриации библиотека отображения инкубируется с фиксированными мишенями, а затем тщательно промывается для удаления нереактивных фагов. Конъюгаты обычно элюируются с использованием кислого или высокосолевого раствора и затем амплифицируются в подходящих клетках-хозяевах для обогащения. После 3–5 раундов скрининга получаются антитела с высокой аффинностью.

Методы скрининга фагов в первую очередь включают твердофазный пэннинг, жидкофазный скрининг и клеточный скрининг. Выбор подходящего метода скрининга должен учитывать характеристики целевых молекул, цели процесса скрининга и лабораторную среду.

Положительный скрининг является наиболее фундаментальным методом скрининга фаговых антител, которые связываются с целевыми белками. Отрицательный скрининг служит для устранения неспецифических антител. В процессе скрининга фаговых антител неспецифические антитела могут быть идентифицированы из-за помех от метки целевого антигена, материалов или других антигенов со структурным сходством с целевым антигеном. В таких случаях отрицательный скрининг может повысить эффективность процесса скрининга.

Методы проверки антител обычно включают ИФА, вестерн-блоттинг (ВБ), проточную цитометрию, иммунопреципитацию (ИП), иммунофлуоресценцию (ИФ), иммуногистохимию и различные другие экспериментальные методы. Alpha Lifetech обладает обширным опытом в обнаружении антител и имеет профессиональную экспериментальную команду, гарантирующую эффективность антител в последующих экспериментах.