Платформа для разработки гуманизированных антител

Гуманизированные антитела вызывают минимальную или нулевую реакцию со стороны иммунной системы человека. По данным Cognitive Market Research, объем мирового рынка гуманизации антител в 2024 году составил 92,5 млн долларов США и будет расти со среднегодовым темпом роста (CAGR) в 13,00% в период с 2024 по 2031 год. Компания Alpha Lifetech располагает зрелой платформой гуманизации антител с показателем успешности более 98% для гуманизированных антител. Мы предлагаем множество стратегий гуманизации, включая CDR-трансплантацию, SDR-трансплантацию, перетасовку цепей, фаговый дисплей и т. д., которые могут быть выбраны в соответствии с вашими экспериментальными потребностями. Мы можем обеспечить гуманизацию антител не только от различных видов животных, таких как мыши, кролики, альпаки, верблюды и др., но и в различных формах, таких как scFv, Fab и наноантитела. У нас работают профессиональные технические специалисты, которые предоставляют услуги по производству, очистке и валидации антител, включая производство мышиных моноклональных антител, химерных антител, экспрессию и очистку гуманизированных антител, а также характеристику и анализ гуманизированных антител. Благодаря высокой успешности, высокой чистоте и низкой иммуногенности мы гарантируем производство гуманизированных антител.

Введение в гуманизацию антител

Терапия моноклональными антителами может применяться для лечения аутоиммунных заболеваний, рака и других болезней. Моноклональные антитела производятся путем иммунизации мышей или других животных. При лечении заболеваний на поздней стадии производства моноклональных антител нельзя игнорировать иммуногенность нечеловеческих антител. Основной принцип гуманизации заключается в интеграции остатков нечеловеческого каркаса, таких как гипервариабельные комплементарно-определяющие регионы (CDR), в человеческий каркас, создавая последовательности, которые сохраняют исходные характеристики антител, предотвращая при этом иммуногенность. Иммунизация мышей и последующая гуманизация мышиной последовательности остаются двумя основными путями открытия терапевтических антител, которые в основном проходят несколько этапов: производство мышиных антител, химеризация моноклональных антител, химерные мышино-человеческие моноклональные антитела и процесс разработки полностью гуманизированных моноклональных антител. В настоящее время исследования в основном включают трансгенных мышей (перенос генов человеческих В-клеток в мышей), высокопроизводительный скрининг с использованием дрожжевой или фаговой дисплейной технологии, трансплантацию CDR (вставку родительских CDR в человеческие последовательности), определение специфических для трансплантата остатков (SDR), перетасовку каркаса и другие методы.

Рис. 1: Схематический обзор процесса гуманизации антител от мышиных антител (зеленые области) до полностью человеческих антител.

Стратегия гуманизации антител

Прививка CDR

Прививка CDR-последовательностей осуществляется с помощью системы экспрессии в клетках млекопитающих, основанной на технологии рекомбинантной ДНК, и ее основные этапы включают:

(1) Разработать соответствующие антитела у мышей (или нечеловеческих источников), выделить ДНК, кодирующую антитела, и клонировать их в векторы для секвенирования (или непосредственно выполнить секвенирование отдельных клеток).

(2) Определить последовательность ДНК, соответствующую CDR антитела, и определить специфичность связывания с мишенью;

(3) Выберите область каркаса человека (FR) для трансплантации нечеловеческих CDR и сконструируйте новый ген антитела.

(4) Провести трехмерный анализ конфликтов между нечеловеческими CDR и человеческими FR для создания восстановительных мутаций, чтобы стабилизировать петлю и предотвратить потерю аффинности или структурной целостности конечного гуманизированного антитела.

Рис. 2: Схематический обзор процесса прививки комплементарно-определяющего региона (CDR).

Перетасовка фреймворков

Метод перетасовки каркасов основан на технологии фагового дисплея и технологии скрининга фаговых библиотек для получения высокоаффинных антител. В качестве матриц используются олигонуклеотиды, кодирующие каркасы тяжелых цепей человеческих антител, в качестве праймеров кодируются CDR-регионы, а для получения одноцепочечной ДНК проводится ПЦР-амплификация продукта ПЦР. Одноцепочечная ДНК генов VL и VH, очищенная стрептавидином, реконструируется на векторах с использованием ДНК-лигазы T4 и рестрикционных ферментов, инкубируется с бактериофагами и амплифицируется бактериофагами, после чего создается библиотека фагового дисплея. Проводится три раунда скрининга с соответствующими антигенами, а положительные клоны окончательно подтверждаются с помощью ИФА и других методов.

Рис. 3: Схематическое изображение стратегий гуманизации, включающих трансплантацию комплементарно-определяющего региона (CDR) и перетасовку каркаса (FR). (A) Основная процедура трансплантации CDR. (B) Основной процесс перетасовки FR. (Источник: Ван Юнмэй и др., Сравнение методов «перетасовки структуры» и «трансплантации CDR» при гуманизации мышиного антитела к PD-1.)

Фаговый дисплей

Производство гуманизированных антител основано на методе отображения специфических антител на поверхности бактериофагов, в основном созданных с использованием фаговых библиотек человеческих антител. Источником библиотеки являются мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC), выделенные из периферической крови человека, из которых затем отбираются соответствующие последовательности. Эта последовательность содержит полную человеческую последовательность, но полученные антитела представляют собой фрагменты антител, такие как scFv, Fab и наноантитела.

Рабочий процесс службы гуманизации антител

Этапы обслуживания	Стандарт контроля качества	Хронология
Выделение антител	Чистота >95%	1-2 недели
Анализ последовательностей	Точная идентификация последовательностей, не относящихся к человеческому организму.	1 неделя
Прививка CDR и прививка каркаса	Успешная интеграция и выражение	2-3 недели
Экспрессия и очистка	Высокий выход и чистота	2-3 недели
Функциональная валидация	Оценка аффинности и специфичности	1 неделя

Преимущества платформы гуманизации антител

Компания Alpha Lifetech располагает отлаженной платформой для гуманизации антител, обеспечивающей показатель успешности получения гуманизированных антител более 98%.