Платформа разработки гуманизации антител

Гуманизированные антитела вызывают минимальный или нулевой ответ со стороны иммунной системы человека. По данным Cognitive Market Research, мировой рынок гуманизации антител в 2024 году составит 92,5 млн долларов США и будет расширяться с годовым темпом прироста (CAGR) 13,00% с 2024 по 2031 год. Alpha Lifetech имеет зрелую платформу гуманизации антител с показателем успешности более 98% для гуманизированных антител. У нас есть несколько стратегий гуманизации, включая прививку CDR, прививку SDR, перетасовку цепей, фаговый дисплей и т. д., которые можно выбрать в соответствии с вашими экспериментальными потребностями. Мы можем не только обеспечить гуманизацию антител из разных видов, таких как мыши, кролики, альпаки, верблюды и т. д., но и гуманизацию антител в различных формах, таких как scFv, Fab и нанотела. У нас есть профессиональный технический персонал для предоставления услуг по производству, очистке и валидации антител, включая производство мышиных моноклональных антител, производство химерных антител, экспрессию и очистку гуманизированных антител, а также характеристику и анализ гуманизированных антител. Благодаря высокому уровню успешности, высокой чистоте и низкой иммуногенности мы гарантируем производство гуманизированных антител.

Введение в гуманизацию антител

Терапия моноклональными антителами может использоваться для лечения аутоиммунных заболеваний, рака и других заболеваний. Моноклональные антитела производятся путем иммунизации мышей или других животных. При использовании для лечения заболеваний на поздней стадии производства моноклональных антител нельзя игнорировать иммуногенность нечеловеческих антител. Основной принцип гуманизации заключается в интеграции нечеловеческих остатков каркаса, таких как гипервариабельные области, определяющие комплементарность (CDR), в человеческий каркас, производя последовательности, которые сохраняют исходные характеристики антител, предотвращая при этом иммуногенность. Иммунизация мышей и последующая гуманизация последовательностей мышей остаются двумя основными путями открытия терапевтических антител, которые в основном проходят несколько стадий: производство мышиных антител, химеризация моноклональных антител, химерное мышиное человеческое моноклональное антитело и процесс разработки полностью гуманизированного моноклонального антитела. В настоящее время исследования в основном включают трансгенных мышей (перенос генов В-клеток человека мышам), высокопроизводительный скрининг с использованием технологии дрожжевого или фагового дисплея, трансплантацию CDR (вставку родительских CDR в последовательности человека), определение остатков, специфичных для трансплантации (SDR), перестановку каркаса и другие методы.

Рис. 1: Схематический обзор гуманизации антител от мышиных антител (зеленые домены) до полностью человеческих антител.

Стратегия гуманизации антител

Прививка CDR

Прививка CDR осуществляется с помощью системы экспрессии млекопитающих, основанной на технологии рекомбинантной ДНК, и ее основными этапами являются:

(1) Разработать соответствующие антитела у мышей (или нечеловеческих источников), выделить ДНК, кодирующую антитела, и клонировать их в векторы для секвенирования (или напрямую выполнить секвенирование отдельных клеток).

(2) Определить последовательность ДНК, соответствующую CDR антитела, и определить специфичность связывания мишени;

(3) Выберите каркасную область человека (FR) для трансплантации нечеловеческих CDR и конструирования нового гена антитела.

(4) Провести трехмерный анализ конфликтов между нечеловеческими CDR и человеческими FR для генерации восстановительных мутаций с целью стабилизации петли и предотвращения потери аффинности или структурной целостности конечного гуманизированного антитела.

Рис. 2: Схематический обзор прививки области, определяющей комплементарность (CDR).

Перетасовка фреймворков

Перетасовка каркасов основана на технологии фагового дисплея и технологии скрининга фаговой библиотеки для получения высокоаффинных антител. Олигонуклеотиды, кодирующие каркасы тяжелой цепи человеческих антител, используются в качестве шаблонов, области CDR кодируются как праймеры, и ПЦР-амплификация выполняется для денатурации продукта ПЦР для получения одноцепочечной ДНК. Одноцепочечная ДНК генов VL и VH, очищенная стрептавидином, реконструируется на векторах с использованием ДНК-лигазы T4 и рестрикционных ферментов, инкубируется с бактериофагами и амплифицируется бактериофагами, и создается библиотека фагового дисплея. Проводятся три раунда скрининга с соответствующими антигенами, и положительные клоны окончательно проверяются с помощью ИФА и других методов.

Рис. 3: Схематическая иллюстрация стратегий гуманизации пересадки области определения комплементарности (CDR) и перетасовки каркаса (FR). (A) Основная процедура пересадки CDR. (B) Основной процесс перетасовки FR. (Источник ссылки:Ван Юнмей и др., Сравнение «перетасовки каркаса» и «прививки CDR» при гуманизации мышиного антитела PD-1.)

Фаговый дисплей

Производство гуманизированных антител основано на методе отображения специфических антител на поверхности бактериофагов, в основном сконструированных с помощью библиотек фагов человеческих антител. Источником библиотеки являются PBMC, выделенные из периферической крови человека для конструирования библиотек фагов, из которых отбираются соответствующие последовательности. Эта последовательность имеет полную человеческую последовательность, но полученные антитела представляют собой фрагменты антител, такие как scFv, Fab и нанотела.

Рабочий процесс службы гуманизации антител

Этапы обслуживания	Стандарт контроля качества	Хронология
Изоляция антител	Чистота >95%	1-2 недели
Анализ последовательности	Точная идентификация нечеловеческих последовательностей	1 неделя
Прививка CDR и прививка каркаса	Успешная интеграция и самовыражение	2-3 недели
Выражение и очищение	Высокая урожайность и чистота	2-3 недели
Функциональная проверка	Оценка сродства и специфичности	1 неделя