Служба исследований аптамеров

В соответствии с различными аналитическими потребностями клиентов, компания Alpha Lifetech предлагает широкий выбор стратегий анализа аптамеров.

СВЯЗАТЬСЯ С НАМИ

Служба исследований аптамеров

Введение в аптамеры

Аптамеры — это одноцепочечные молекулы нуклеиновых кислот (таких как ДНК или РНК), которые отбираются in vitro из библиотеки синтетических олигонуклеотидов со случайно подобранными последовательностями в процессе, называемом SELEX-скринингом, который включает в себя несколько раундов итеративного отбора. Основные компоненты услуг по разработке аптамеров, предоставляемых компанией Alpha Lifetech, включают в себя создание библиотек аптамеров, SELEX-скрининг аптамеров, секвенирование аптамеров методом SELEX, анализ последовательностей аптамеров и другие виды анализа аптамеров.

Метод SELEX-секвенирования сочетает в себе скрининг аптамеров с помощью SELEX и высокопроизводительное секвенирование. Благодаря SELEX-секвенированию аптамеров можно эффективно определить специфическую последовательность аптамера, связанного с мишенью, что обеспечивает базовые данные для последующего анализа последовательности аптамеров и их применения.

Аптамеры широко используются в научных исследованиях, лечении заболеваний, создании биосенсоров, разработке лекарств и мониторинге окружающей среды. Однако олигонуклеотидные аптамеры, протестированные in vitro, легко деградируют in vivo и даже проявляют токсичность. Поэтому после оптимизации протестированных аптамеров необходим анализ in vitro для оценки успешности их разработки. В соответствии с различными потребностями клиентов в анализе, компания Alpha Lifetech предлагает клиентам на выбор различные стратегии анализа аптамеров.

Рис. 1. Схема анализа аптамеров. Источник:Тевендран Р., Цитартан М. 2022. Методы оценки сродства связывания аптамеров..

Введение в службу исследований аптамеров

Анализ стабильности аптамеров

Эксперимент по деградации с помощью нуклеазы

Путем инкубации аптамера с различными типами нуклеаз (такими как ДНКаза, РНКаза и др.) в определенных условиях наблюдается деградация аптамера, что позволяет оценить его устойчивость к деградации. Это полезно для определения стабильности и долговечности аптамера в практических приложениях.

метод флуоресцентной маркировки

Стабильность аптамера оценивается косвенно путем мечения флуорофоров на аптамере и наблюдения за изменениями флуоресцентного сигнала до и после связывания с мишенью. Например, при связывании аптамера с мишенью его конформация может изменяться, что приводит к усилению или ослаблению флуоресцентного сигнала.

Анализ термической стабильности

Термическая стабильность аптамера оценивается путем измерения изменения его температуры плавления (значения Tm) при различных температурах. Чем выше температура плавления аптамера, тем лучше его термическая стабильность.

Анализ динамической устойчивости

Метод поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и другие технологии были использованы для мониторинга процесса связывания и разъединения аптамера и мишени в реальном времени, получения динамических параметров (таких как константа скорости связывания, константа скорости диссоциации и т. д.), дальнейшего понимания механизма взаимодействия между аптамером и мишенью, а также оценки его динамической стабильности.

Анализ структурной устойчивости

Для анализа трехмерной структуры аптамера и его структурной стабильности были использованы рентгеновская кристаллография, ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и другие методы структурной биологии.

Анализ, специфичный для аптамеров

анализ связывания аптамеров

Сродство оценивается с помощью анализа связывания аптамеров, измеряющего константу связывания между аптамером и целевой молекулой, например, константу диссоциации Kd. Более низкое значение Kd указывает на более высокое сродство. Анализ связывания аптамеров позволяет отбирать лекарственные препараты с высокой связывающей способностью, после чего можно проводить дальнейшие фармакодинамические и фармакокинетические исследования.

Эксперимент по обратному скринингу

Обратный скрининг — это метод скрининга, позволяющий быстро исключить нецелевые молекулы из большого числа потенциальных кандидатов. Обратный скрининг предназначен для исключения молекул, не обладающих этим свойством или функцией. Ключевым моментом обратного скрининга является выбор соответствующих маркеров или условий, позволяющих идентифицировать и удалять нецелевые молекулы в процессе скрининга. В этом эксперименте выбор нецелевых молекул очень важен. Необходимо убедиться, что выбранные нецелевые молекулы представляют вещества, которые могут мешать скринингу аптамеров, и что возможные мешающие факторы охвачены максимально полно.

Эксперимент по конкурентному торможению

Добавление избыточного количества конкурентов (таких как молекулы, имеющие сходную структуру с целевой молекулой) в систему связывания аптамера и целевой молекулы приводит к изменению способности аптамера и целевой молекулы к связыванию. Если способность аптамера связываться с целевой молекулой значительно снижается, это указывает на высокую специфичность аптамера.

В некоторых случаях эксперименты по конкурентному ингибированию могут использоваться как часть или дополнение к экспериментам по обратному скринингу. Например, в процессе скрининга лекарственных препаратов способность молекулы лекарственного средства связываться с целевым белком может быть оценена с помощью экспериментов по конкурентному ингибированию, а затем эксперименты по обратному скринингу могут быть использованы для исключения тех соединений, которые слишком прочно связываются с нормальными клетками или тканями.

Анализ цитотоксичности аптамеров

Существует множество экспериментальных методов анализа цитотоксичности аптамеров, предназначенных для оценки влияния аптамеров на выживаемость, пролиферацию или функцию клеток.

Методы	Подробное введение	Преимущество	Недостаток
Метод определения MTT	МТТ-анализ — это метод, основанный на активности ферментов в митохондриях живых клеток. Сукцинатдегидрогеназа в митохондриях живых клеток может восстанавливать экзогенный МТТ до нерастворимого в воде сине-фиолетового кристалла формазана и осаждать его в клетке, тогда как мертвые клетки такой функции не выполняют. Растворение этих кристаллов диметилсульфоксидом (ДМСО) и измерение поглощения на определенных длинах волн (например, 490 нм или 570 нм) с помощью ферментного дозатора позволяет косвенно оценить количество живых клеток и, таким образом, цитотоксичность аптамера.	Высокая чувствительность, экономичность и удобство	Высокая рабочая нагрузка, органические растворители могут нанести вред клеткам; можно получить только окончательные результаты эксперимента, а полный процесс цитотоксичности наблюдать невозможно.
Метод определения CCK-8	Набор для подсчета клеток Cell Counting Kit-8 (CCK-8) — это высокочувствительный нерадиоактивный колориметрический метод определения. CCK-8 содержит WST-8, который восстанавливается дегидрогеназой в митохондриях живых клеток, образуя высокорастворимый в воде оранжевый метилзамин. Количество образующегося мезанового красителя линейно зависит от числа живых клеток, а число живых клеток можно косвенно отразить, измерив значение поглощения света мезановым красителем на длине волны 450 нм, что позволяет оценить цитотоксичность аптамера.	Простота в использовании, не требует промывки клеток, быстрое обнаружение, широкий линейный диапазон обнаружения, высокая чувствительность, хорошая воспроизводимость, низкая цитотоксичность.	Высокая стоимость реагентов; иногда сложно определить, связано ли снижение поглощения с уменьшением количества живых клеток или со снижением активности самой клеточной дегидрогеназы.
Метод определения ЛДГ	ЛДГ (лактатдегидрогеназа) — это фермент, стабильный в цитоплазме клеток, и при повреждении клеточной мембраны ЛДГ высвобождается за пределы клетки. ЛДГ катализирует превращение молочной кислоты в пируват и реагирует с INT (тетразолиевыми солями) с образованием пурпурного кристаллического вещества. Измеряя его поглощение на определенной длине волны (например, 490 нм), можно оценить степень повреждения клеток и, следовательно, цитотоксичность аптамера.	Это напрямую отражает скорость гибели клеток, наносит им меньший вред и исключает загрязнение радиоактивными изотопами.	Необходимость частого извлечения клеток из инкубатора усложняет операцию; можно получить только окончательные результаты эксперимента, а полный процесс цитотоксичности наблюдать невозможно.
Анализ изображений живых клеток в режиме реального времени	С помощью анализатора изображений живых клеток в режиме реального времени прибор помещали в инкубатор для наблюдения и записи всего процесса клеточного цикла в реальном времени. Цитотоксичность аптамеров можно оценить путем анализа морфологических изменений и кривых роста клеток. Этот метод позволяет получить видео и количественные результаты цитотоксических процессов, сохраняя при этом стабильную среду для роста клеток.	Он позволяет отслеживать цитотоксический процесс в режиме реального времени, обеспечивает неразрушающую визуализацию, снижает помехи и повреждение клеток; для углубленного анализа доступны как видео, так и количественные результаты.	Оборудование стоит дорого и требует профессиональных навыков эксплуатации и умения анализировать данные.