Служба исследований аптамеров

В соответствии с различными потребностями клиентов в анализе компания Alpha Lifetech предлагает клиентам на выбор различные стратегии анализа аптамеров.

СВЯЗАТЬСЯ С НАМИ

Служба исследований аптамеров

Введение в Аптамер

Аптамеры — это одноцепочечные молекулы нуклеиновых кислот (например, ДНК или РНК), которые проверяются in vitro из библиотеки синтетических олигонуклеотидов со случайно назначенными последовательностями с помощью процесса, называемого скринингом SELEX, который включает несколько раундов итеративного отбора. Основные компоненты услуг по разработке аптамеров, принадлежащих Alpha Lifetech, включают создание библиотеки аптамеров, скрининг аптамеров SELEX, секвенирование аптамеров SELEX, анализ последовательности аптамеров и другие анализы аптамеров.

Секвенирование SELEX объединяет скрининг аптамеров SELEX и высокопроизводительное секвенирование. С помощью секвенирования аптамеров SELEX можно эффективно определить конкретную последовательность аптамера, связанного с мишенью, что дает основные данные для последующего анализа и применения последовательности аптамера.

Аптамеры широко используются в научных исследованиях, лечении заболеваний, создании биосенсоров, открытии лекарств и мониторинге окружающей среды. Однако аптамеры олигонуклеотидов, проверенные in vitro, легко разрушались in vivo и даже проявляли токсичность. Поэтому после оптимизации проверенных аптамеров требуется анализ in vitro для оценки успешности разработки аптамеров. В соответствии с различными потребностями клиентов в анализе Alpha Lifetech предлагает клиентам на выбор различные стратегии анализа аптамеров.

Рис.1 Схема анализа аптамеров. Источник ссылки:Тевендран Р., Ситартан М. 2022. Анализы для оценки связывающей способности аптамеров.

Введение в службу исследований аптамеров

Анализ стабильности аптамера

Эксперимент по деградации нуклеазы

Инкубируя аптамер с различными типами нуклеаз (такими как ДНКаза, РНКаза и т. д.) в определенных условиях, можно наблюдать за деградацией аптамера, чтобы оценить его способность противостоять деградации. Это полезно для определения стабильности и долговечности аптамера в практических приложениях.

Метод флуоресцентной маркировки

Стабильность аптамера оценивается косвенно путем маркировки флуорофоров на аптамере и наблюдения за изменениями сигнала флуоресценции до и после связывания с мишенью. Например, когда аптамер связывается с мишенью, его конформация может измениться, что приведет к усилению или ослаблению сигнала флуоресценции.

Анализ термической стабильности

Термическая стабильность аптамера оценивается путем измерения изменения его температуры плавления (значение Tm) при различных температурах. Чем выше температура плавления аптамера, тем лучше его термическая стабильность.

Анализ динамической устойчивости

Поверхностный плазмонный резонанс (ППР) и другие технологии использовались для мониторинга процесса связывания и разделения между аптамером и мишенью в режиме реального времени, получения динамических параметров (таких как константа скорости связывания, константа скорости диссоциации и т. д.), дальнейшего изучения механизма взаимодействия между аптамером и мишенью и оценки его динамической стабильности.

Анализ структурной устойчивости

Для анализа трехмерной структуры аптамера и его структурной стабильности использовались рентгеновская кристаллография, ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и другие методы структурной биологии.

Аптамер-специфический анализ

Анализ связывания аптамеров

Сродство оценивается путем проведения анализа связывания аптамера для измерения константы связывания между аптамером и целевой молекулой, такой как константа диссоциации Kd. Более низкое значение Kd указывает на более высокое сродство. Анализ связывания аптамера может отсеивать кандидаты на лекарственные средства с высокой способностью связывания, а затем проводить последующие исследования фармакодинамики и фармакокинетики.

Эксперимент по обратному скринингу

Анализ обратного скрининга — это метод скрининга для быстрого исключения нецелевых молекул из большого числа молекул-кандидатов. Обратный скрининг предназначен для исключения молекул, которые не обладают этим свойством или функцией. Ключ к обратному скринингу — выбор соответствующих маркеров обратного скрининга или условий, которые позволяют идентифицировать и удалять нецелевые молекулы в процессе скрининга. В этом эксперименте выбор нецелевых молекул очень важен. Следует убедиться, что выбранные нецелевые молекулы являются репрезентативными для веществ, которые могут помешать скринингу аптамеров, и что возможные мешающие факторы охвачены как можно более полно.

Эксперимент по конкурентному ингибированию

Добавляя избыточные конкуренты (например, молекулы со структурой, похожей на целевую молекулу) в систему связывания аптамера и целевой молекулы, можно наблюдать изменение связывающей способности аптамера и целевой молекулы. Если способность аптамера связывать целевую молекулу значительно снижается, это указывает на то, что аптамер обладает высокой специфичностью.

В некоторых случаях эксперименты по конкурентному ингибированию могут использоваться как часть или дополнение к экспериментам по обратному скринингу. Например, в процессе скрининга лекарств способность молекулы лекарства связываться с целевым белком может быть оценена с помощью экспериментов по конкурентному ингибированию, а затем эксперименты по обратному скринингу могут использоваться для удаления тех соединений, которые слишком сильно связаны с нормальными клетками или тканями.

Анализ цитотоксичности аптамеров

Существует множество экспериментальных методов анализа цитотоксичности аптамеров, которые предназначены для оценки влияния аптамеров на выживаемость, пролиферацию или функционирование клеток.

Методы	Подробное введение	Преимущество	Недостаток
Метод обнаружения МТТ	Анализ МТТ — это метод, основанный на активности фермента в митохондриях живых клеток. Сукцинатдегидрогеназа в митохондриях живых клеток может восстанавливать экзогенный МТТ до нерастворимого в воде сине-фиолетового кристалла формазана и откладывать его в клетке, в то время как мертвые клетки не имеют такой функции. Растворение этих кристаллов диметилсульфоксидом (ДМСО) и определение поглощения на определенных длинах волн (например, 490 нм или 570 нм) на энзимометре может косвенно отражать количество живых клеток и, таким образом, оценивать цитотоксичность аптамера.	Высокая чувствительность, экономичность и удобство	Большая рабочая нагрузка, органические растворители могут вызвать повреждение клеток; можно получить только окончательные экспериментальные результаты, а полный процесс цитотоксичности невозможно просмотреть.
Метод обнаружения CCK-8	Cell Counting Kit-8 (CCK-8) — это высокочувствительный, нерадиоактивный колориметрический метод обнаружения. CCK-8 содержит WST-8, который восстанавливается дегидрогеназой в митохондриях живых клеток для получения высокорастворимого в воде оранжевого метилзанового топлива. Количество произведенного красителя мезан линейно связано с количеством живых клеток, и количество живых клеток может быть косвенно отражено путем измерения значения поглощения света красителем мезан на длине волны 450 нм, чтобы оценить цитотоксичность аптамера.	Простота эксплуатации, нет необходимости промывать клетки, быстрое обнаружение, широкий линейный диапазон обнаружения, высокая чувствительность, хорошая повторяемость, низкая цитотоксичность	Высокая стоимость реагента; Иногда трудно сказать, вызвано ли снижение поглощения уменьшением количества живых клеток или снижением активности самой клеточной дегидрогеназы.
Метод обнаружения ЛДГ	ЛДГ (лактатдегидрогеназа) — это фермент, который стабилен в цитоплазме клеток, и когда клеточная мембрана повреждена, ЛДГ высвобождается за пределы клетки. ЛДГ может катализировать молочную кислоту с образованием пирувата и реагировать с ИНТ (солями тетразолия) с образованием фиолетового кристаллического вещества. Измеряя его поглощение на определенной длине волны (например, 490 нм), можно отразить степень повреждения клетки, а затем оценить цитотоксичность аптамера.	Он напрямую отражает уровень гибели клеток, наносит им меньший ущерб и не загрязняет их радиоактивными изотопами.	Необходимость частого извлечения клеток из инкубатора, операция более сложная; можно получить только окончательные экспериментальные результаты, а полный процесс цитотоксичности просмотреть невозможно
Анализ изображений живых клеток в реальном времени	Используя анализатор изображений живых клеток в реальном времени, прибор был помещен в инкубатор для наблюдения и записи всего процесса цикла роста клеток в реальном времени. Цитотоксичность аптамеров можно оценить, проанализировав морфологические изменения и кривые роста клеток. Этот метод может предоставить видео и количественные результаты цитотоксических процессов, сохраняя при этом стабильную среду роста клеток.	Он может контролировать цитотоксический процесс в режиме реального времени, неразрушающую визуализацию, уменьшать помехи и повреждение клеток; как видео, так и количественные результаты доступны для углубленного анализа.	Стоимость оборудования высока и требует профессиональных навыков эксплуатации и способности анализировать данные.