Существует гораздо больше терапевтических моноклональных антител, чем упомянуто выше, поэтому разработка моноклональных антител, нацеленных на соответствующие мишени, продолжается. Однако одним из основных препятствий для разработки традиционных форм антител является большая молекулярная масса моноклональных антител, что делает исследования более мелких форм антител актуальной темой. Однодоменные антитела (VHH), антигенсвязывающие фрагменты (Fab) и одноцепочечные антитела (scFv). Также ведется разработка библиотек антител, в которых более мелкие фрагменты антител обеспечивают гладкое отображение на поверхностях фагов. Антитело-фаговый дисплей — это технология, которая позволяет изолировать фрагменты антител, специфичные к целевым антигенам in vitro. Функциональное разнообразие и специфичность библиотеки (такие как стабильность фолдинга, уровень экспрессии, растворимость и правильная сборка в фаговые частицы) определяют качество библиотеки антител, что имеет решающее значение для идентификации связывающих агентов с желаемой целевой специфичностью и характеристиками. Другими препятствиями для разработки терапевтических моноклональных антител являются легкая агрегация белков антител (в основном определяемая вариабельной областью) и образование димерных вариабельных форм scFv (ди scFv, би scFv).

Рис. 1: структура scFv и другие форматы

Однодоменные антитела (sdAbs) получают от альпак, пум и акул. В настоящее время они являются самыми маленькими и наиболее связывающими антителами, их молекулярная масса составляет всего 12–15 кДа, в то время как полноразмерные антитела имеют молекулярную массу 150–160 кДа, Fab – около 50 кДа, а scFv – около 25 кДа. Из-за отсутствия доменов CH1 в лёгких и тяжёлых цепях традиционных антител однодоменные антитела с большей вероятностью проникают через гематоэнцефалический барьер, чем другие формы антител. Кроме того, однодоменные антитела имеют стабильную структуру, могут длительно храниться при высоких температурах, плохо разрушаются протеазами и обладают преимуществом устойчивости к кислотам и щелочам, что способствует повышению их биодоступности. Хотя у однодоменных антител отсутствуют лёгкие цепи, они всё же способны прочно связываться с антигенами, как и традиционные антитела, благодаря длинному CDR3. Кроме того, CDR3 однодоменных антител может образовывать вогнуто-выпуклую структуру, что обеспечивает лёгкое распознавание антиген-скрытых эпитопов. Однодоменные антитела имеют простую структуру с единственной вариабельной областью тяжёлой цепи и отсутствием посттрансляционных модификаций, что позволяет легко трансформировать их в различные формы и экспрессировать в больших масштабах в прокариотических и эукариотических системах экспрессии, значительно снижая экспериментальные затраты. Однако основное отличие между традиционными вариабельными областями и природными однодоменными антителами заключается в наличии рамки считывания 2 (FR2), что может приводить к плохой растворимости и стабильности доменов VH, не относящихся к верблюдовым. Синтетические библиотеки VH sdAb, основанные на каркасах человеческих вариабельных доменов (многие из которых содержат последовательности FR2, подобные верблюдовым), могут быть привлекательной альтернативой для иммунитета животных семейства верблюдовых.

Рис. 2: Структура однодоменного антитела (VHH)

Рис. 3: Связывающая активность sdAb до и после термической обработки

Как показано на рисунке 4, был проведен анализ ELISA для оценки его связывающей активности против RBD Fc SARS-CoV-2, человеческого ACE2 HEL, CARS1 и При тестировании набора антигенов, включая овальбумин и HSA, все шесть клонов значительно связывались только со своими целевыми антигенами и не связывались значительно с нецелевыми антигенами, что подтверждает высокую специфичность проверенных антигенов.

Рис. 4: Оценка специфичности связывания с помощью ИФА

Последний автор идентифицировал оптимизированную последовательность FR2 животных, не относящихся к верблюдовым, на основе человеческого VH3 sdAb, которая обладает такими характеристиками, как высокая степень очистки, высокая термостабильность и высокое содержание мономера. Разнообразие CDR было введено в структуру VH, и сконструированная библиотека sdAb позволила проводить скрининг специфичных к мишени конъюгатов с идеальными свойствами.

Ли, Н. Дж., Юнг, М., Янг, Х.Й. и др. Библиотека однодоменных антител на основе стабилизированного каркаса человеческого VH3. Sci Rep 14, 17747 (2024). https://doi.org/10.1038/s41598-024-68680-5