Служба построения библиотеки фагового дисплея

Alpha Lifetech имеет комплексную платформу отображения фагов M13/T7 для обеспечения создания и производства библиотек антител. Мы также можем предоставлять индивидуальные услуги, такие как производство антител scFv, чтобы удовлетворить ваши потребности.

СВЯЗАТЬСЯ С НАМИ

Служба построения библиотеки фагового дисплея

Alpha Lifetech много лет глубоко вовлечена в технологию отображения фагов. Она создала идеальную стабильную платформу технологии отображения фагов, которая экономит время на научные исследования или проектные исследования и облегчает последующее производство. Alpha Lifetech также может предоставлять клиентам такие услуги, как производство антител vhh, производство антител scFv, производство антител Fab.

Alpha Lifetech имеет комплексную платформу отображения фагов M13/T7 для обеспечения создания и производства библиотек антител. Мы также можем предоставлять индивидуальные услуги, такие как производство антител scFv и высокопроизводительный скрининг антител, чтобы удовлетворить ваши потребности.

Введение в фаговый дисплей

Технология фагового дисплея — это метод, который использует фаги (вирус, который заражает бактерии) для поиска функциональных связывающих молекул определенных белков или пептидов. Методы построения фаговой библиотеки антител включают построение библиотеки Fab-антител, построение библиотеки антител scFv, построение библиотеки нанотел и т. д. В зависимости от типа бактериофагов их можно разделить на системы M13, T7, T4, λ и другие. В зависимости от типа библиотеки ее можно разделить на библиотеку случайных пептидов, библиотеку кДНК, библиотеку антител и библиотеку белков. Технология фагового дисплея проста в эксплуатации и недорога в использовании. Однако этот метод ограничивает разнообразие молекулярной генетики в библиотеке, которая не может выражать слишком длинные последовательности,

В настоящее время широко используется технология фагового дисплея. Среди них можно отметить значительные достижения в исследовании и разработке новых вакцин (недорогих и эффективных синтетических вакцин), разработке препаратов антител (скрининг ингибиторов ферментов), трансдукции клеточного сигнала (скрининг моделируемых эпитопов), исследовании эпитопов антигенов (получение моноклональных антител).

Введение в бактериофаг Т7

Бактериофаг Т7 представляет собой двухцепочечную ДНК, длина ДНК составляет 40 кб, и заключен в капсид диаметром 60 нм. Соединитель между головкой и хвостом представляет собой кольцевую структуру, состоящую из нескольких копий gp8. Головка и ядро бактериофага Т7 образуют цилиндрическую структуру, которая связывается с gp8 и может соединять головку и хвост.

Рис. 1 Схематическое изображение бактериофага Т7.(Ссылка:Достижения в области системы отображения фага Т7 (обзор))

Введение в бактериофаг M13

Бактериофаг M13 принадлежит к группе нитевидных фагов, которые в совокупности называются фагами Ff. Он имеет длину 900 нм и ширину 6,5 нм. Он содержит геном одноцепочечной ДНК (ssDNA) длиной 6407 п.н., который состоит из девяти генов, кодирующих 11 различных белков. Среди них пять белков являются белками оболочки, а шесть белков участвуют в репликации и сборке фага. Самая высокая концентрация белков оболочки приходится на белок капсида G8P, который состоит примерно из 2700 белковых единиц и образует оболочку вокруг хромосомы.

Рис. 2 Схематическое изображение бактериофага М13.(Ссылка:Основы технологии отображения фагов антител)

Введение в библиотеку фаговых антител

Открытие антител становится все более важным в современной медицине. Существуют различные подходы к открытию антител, но библиотека антител с фаговым дисплеем используется в медицинской науке больше.

С 1990 года для создания фаговых библиотек использовались различные форматы антител, включая VH, VHH, scFv, диатела и антитела Fab. ScFv, состоящие из структурных доменов VH и VL, представляют собой одноцепочечные антитела, используемые для создания библиотек антител scFv. scFv характеризуется коротким периодом полураспада и низкой иммуногенностью. Библиотека антител Fab состоит из VH, VL, CL и CH1, которые могут быстро отсеивать идеальные антитела с высокой аффинностью. Наименьшая единица, которая может связывать целевой антиген - VHH, в настоящее время составляет библиотеку нанотел, VHH обладает преимуществами простой структуры, малого объема, высокой растворимости, хорошей стабильности и простоты приготовления и экспрессии. Библиотеки синтетических нанотел (Nb) становятся привлекательной альтернативой иммунизации животных для получения стабильных, высокоаффинных синтетических нанотел. Как правило, эти фрагменты антител сливаются с G3P фага M13, и путем клонирования большого количества генов, кодирующих фрагмент антитела, можно создать большие библиотеки фаговых дисплеев антител, из которых можно выбрать множество разнообразных антител.

Процесс создания фаговой библиотеки

Процесс создания библиотеки фагов выглядит следующим образом: разрабатываются специфические праймеры для ПЦР-амплификации, которая получает продукты, которые ферментативно лигируются с вектором фага T7/M13, и успешно создается рекомбинантная фаговая плазмида. Рекомбинантная фаговая плазмида трансформируется в клетки рецептора TG1, затем покрывается средой, содержащей соответствующие антибиотики, и после скрининга трансформаторов проводится расширенная культура. После нескольких раундов культивирования фаг реплицирует время репликации в бактериях и успешно экспрессирует целевой белок или полипептид. Затем фаговая библиотека очищается для удаления некоторых примесей и несвязанных фагов.

Вариабельные области (VH и VL) коррелировали с разнообразием антител, и VH и VL были вставлены в фаговый вектор вместе с последовательностью, кодирующей фаговый белок PIII. После сборки фаговая частица экспонируется и сливается с N-концом минорного белка оболочки III для формирования функционального фрагмента антитела, получая библиотеку, содержащую последовательность ДНК антитела.

После окончания иммунизации определяли титр, и после квалификации титра брали кровь у животных. Из крови выделяли лимфоциты, извлекали РНК, ОТ-ПЦР амплифицировали целевой фрагмент и получали фрагмент гена V-области. Ген V амплифицировали с использованием специфического праймера.

Созданные естественные библиотеки включают в себя слабые иммуногенные антитела у животных, которые могут нацеливаться на любую цель. Фаговые антитела, которые специфически связываются с антигеном, могут быть собраны с помощью методов скрининга, которые фиксируют или маркируют антиген.

Целевой антиген фиксируется на твердом носителе, например, на лунке микропланшета, или соединяется с магнитной бусиной. Затем добавляется библиотека фаговых антител для связывания его с антигеном. После многократного элюирования низкоаффинные или неспецифические фаги смываются, а те, которые демонстрируют специфические антитела, сохраняются.

Применение фагового дисплея

*Открытие антител становится все более важным в современной медицине. Существуют различные подходы к открытию антител, но технология фагового дисплея больше используется в медицинской науке. С 1990 года для создания фаговых библиотек использовались различные форматы антител, включая VH, VHH, scFv, диатела и Fab-антитела.
*Библиотеки фаговых пептидов позволяют быстро определять последовательность белковых эпитопов и стали мощным инструментом для исследования взаимодействия между эпитопами и антигенными рецепторами.
*Фрагменты антител сливаются с G3P фага M13, и путем клонирования большого количества генов, кодирующих фрагмент антитела, можно создать большие библиотеки фаговых дисплеев антител, из которых можно выбрать множество разнообразных антител.
*Система фагового дисплея Т7 имеет много преимуществ, включая простоту, высокую безопасность, стабильность, удобство хранения и транспортировки, поэтому ее используют в профилактических и терапевтических вакцинах.
*Система фагового дисплея Т7 может обнаруживать различные антигены, такие как поверхностные антигены патогенных микроорганизмов и раковые антигены.

Фаг