Услуги по созданию библиотек синтетических материалов

Компания Alpha Lifetech располагает комплексной платформой для фагового дисплея M13/T7, обеспечивающей создание и производство библиотек антител.

СВЯЗАТЬСЯ С НАМИ

Услуги по созданию библиотек синтетических материалов

Введение в услугу по созданию библиотек синтетических микросхемФаб

Библиотеки антител обычно делятся на нативные, иммунные и синтетические. К библиотекам антител относятся библиотеки антител, полученные методом фагового дисплея, библиотеки антител, полученные методом бесклеточного молекулярного дисплея (библиотеки антител, полученные методом рибосомного дисплея, библиотеки антител, полученные методом мРНК-дисплея, библиотеки антител, полученные методом ДНК-дисплея), библиотеки антител, полученные методом дисплея на поверхности клеток (библиотеки антител, полученные методом дисплея на поверхности бактерий, библиотеки антител, полученные методом дисплея на поверхности грибов, библиотеки антител, полученные методом дисплея на поверхности дрожжей, библиотеки антител, полученные методом дисплея на поверхности клеток млекопитающих).

Fab-фрагмент представляет собой полный фрагмент антитела, состоящий из VH-цепи и константной области тяжелой цепи CH1, VL-цепи и константной области легкой цепи CL, которые соединены межцепочечными дисульфидными связями, образуя гетеродимеры, и имеет только один полный сайт связывания антигена. Его молекулярная масса составляет примерно 1/3 от полной молекулы IgG, что позволяет быстро отбирать идеальные антитела с высокой аффинностью.

Рис. 1. Структура человеческого IgG и его фрагментов.(Источник: Синтетические антитела при инфекционных заболеваниях - PubMed (nih.gov))

Фаговый дисплей антител

Антитела являются неотъемлемой частью иммунной системы позвоночных и функционируют, специфически связываясь с антигенами с высокой аффинностью и специфичностью. С развитием технологий появилась гибридомная технология, и с её помощью было создано первое в мире терапевтическое антитело, одобренное FAD.

Однако моноклональные антитела, полученные с использованием гибридомной технологии, имеют определенные ограничения. При использовании в качестве терапевтических антител для лечения людей они могут вызывать сильную реакцию лица. На этой основе для лечения были разработаны химерные и гуманизированные антитела с низкой иммуногенностью. Недавно разработанные методы мышиного и фагового дисплея позволяют получать полностью человеческие антитела, аминокислотная последовательность которых аналогична человеческим антителам и, следовательно, менее иммуногенна.

Фаговый дисплей антител позволяет получать целевые антитела и преодолевать некоторые ограничения методов получения антител, основанных на иммунитете животных. С 1990 года для создания фаговых библиотек, содержащих антитела, используются различные форматы антител, включая фрагменты антител человека с тяжелым доменом (VH), фрагменты антител лося и акулы с тяжелым доменом (VHH), scFv, антитела к диабету (бивалентные scFv) и полнофрагментные антигенсвязывающие (Fab) антитела.

Компания Alpha Lifetech может предоставить

Компания Alpha Lifetech уже много лет активно занимается технологией фагового дисплея антител. Она разработала идеальную стабильную платформу для фагового дисплея, которая экономит время на научных исследованиях или проектах, а также упрощает последующее производство. Alpha Lifetech также может предоставлять клиентам услуги по фаговому дисплею антител (фаговый дисплей наноантител, фаговый дисплей scFv и фаговый дисплей Fab).

Компания Alpha Lifetech располагает комплексной платформой для фагового дисплея M13/T7, обеспечивающей создание и производство библиотек антител. Мы также можем предоставить индивидуальные услуги, такие как фаговый дисплей scFv, производство Fab-антител и очистка Fab-антител, в соответствии с вашими потребностями.

Пример создания библиотеки синтетических Fab-антител

Хуан Г. разработал новый метод создания библиотек Fab-фрагментов с помощью фагового дисплея, которые можно получить после однократной электропорации, при этом разнообразие библиотеки составляет 10^9-10^10.

Экспериментальный процесс включает в себя: 1) подготовку высокоэффективных электрокомпетентных клеток; 2) выделение dU-ssDNA; 3) олигонуклеотид-направленный мутагенез по методу Кункеля; 4) электропорацию и расчет размера библиотеки; 5) иммуноферментный анализ (ELISA) на основе белка A/L для оценки сворачивания и функционального разнообразия; 6) анализ разнообразия последовательностей ДНК.

Рис. 2. Титрование фагов для расчета размера библиотеки. (Источник: Создание библиотеки синтетических Fab-фрагментов, экспрессируемых на фагах, с заданным разнообразием. - PubMed (nih.gov))

Ким ЮДж провел скрининг библиотеки синтетических фаговых дисплеев Fab-фрагментов на RBD S-белка SARS-CoV-2 и получил моноклональное антитело, способное нейтрализовать SARS-CoV-2, успешно предотвращая проникновение вируса и создавая основу для использования этого антитела в качестве терапевтического средства.

Рис. 3. Сканирование библиотеки синтетических Fab-фрагментов, экспрессируемых на фагах, на иммобилизованном домене связывания рецептора SARS-2 (RBD).(Источник: Нейтрализующие человеческие антитела против коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2, выделенные из библиотеки синтетических Fab-фагов человека. - PubMed (nih.gov))

Услуги по созданию библиотек синтетических Fab-антител

Была успешно сконструирована рекомбинантная фаговая плазмида путем объединения молекулы антитела Fab с одноцепочечным белком оболочки фага (PⅢ или PⅧ), затем она была трансформирована в клетки-рецепторы TG1, нанесена на среду, содержащую соответствующие антибиотики, а затем амплифицирована и культивирована после скрининга на наличие Proteus. После нескольких циклов культивирования фаг многократно реплицируется в бактериях и успешно экспрессирует целевой белок или полипептид. Процесс адсорбции-элюции-амплификации антигена повторяется для скрининга желаемого антитела Fab, а затем для очистки антитела Fab.

Процесс создания библиотеки синтетических Fab-антител

Шаги	Спецификация
Шаг 1: Иммунологический анализ и ИФА-тестирование.	1) Иммунизированные подопытные животные (стандартная иммунизация, 5 инъекций); 2) Определение титра антител в сыворотке крови методом ИФА (4-й и 5-й титры соответственно). Если титр антител после четвертой дозы соответствует требованиям (титр антител в сыворотке крови по ИФА >10^5; титр малых молекул >10^4), то за 7 дней до забора крови провести повторную иммунизацию; если требования не соблюдены, продолжить плановую иммунизацию (предоставить результаты анализа титра и иммунизированную сыворотку заказчику; на основании результатов анализа титра отобрать животных с положительной сывороткой для дальнейшего наблюдения). Титр антител был подтвержден, и мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) были выделены путем взятия образца крови.
Шаг 2: Услуга скрининга моноклональных антител Fab	1) Используя кДНК библиотеки в качестве матрицы, ген V был амплифицирован методом 3-колесной ПЦР. 2) Создание и трансформация вектора фагового дисплея: вектор фагового дисплея для сплайсинга V-гена, трансформация бактерий-хозяев электрическим шоком и создание библиотеки антител. 3) Идентификация: Было случайным образом отобрано 24 клона, и доля положительных результатов была определена методом ПЦР. 4) Стандартные 3 раунда скрининга: секвенирование NGS продуктов третьего раунда; одновременно было отобрано 192 клона для индукции экспрессии и определения методом ELISA. 5) Все положительные клоны были отобраны для секвенирования генов (>60 положительных клонов на скрининг, до 192); 6) Доставка: последовательность Fab-антител 5-10 (неповторяющаяся последовательность); лабораторный отчет, исходные данные анализа, библиотека фагов.
Шаг 3: Рекомбинантная экспрессия моноклональных антител IgG	1) На основании результатов проверки со стороны клиента рекомендуется переформулировать выражение в 5 последовательностях; 2) Создание вектора + экспрессия в клетках + очистка