Служба скрининга библиотеки поверхностного отображения дрожжей

Наши библиотеки дисплеев дрожжей обладают большой емкостью и большим разнообразием, что обеспечивает надежную основу для эффективного скрининга специфических последовательностей антител.

СВЯЗАТЬСЯ С НАМИ

Служба скрининга библиотеки поверхностного отображения дрожжей

Alpha Lifetech специализируется на создании библиотеки дрожжевого дисплея и скрининге библиотек антител, предлагая возможность создавать различные формы библиотек дрожжей и скрининга их на предмет высокой аффинности и специфичности антител для клиентов по всему миру. С командой опытных исследователей, передовыми технологиями и оборудованием мы можем создавать библиотеки дрожжей, нацеленные на широкий спектр белков, связанных с заболеваниями. Мы можем предоставить технологии фагового дисплея и дрожжевого дисплея, включая белковый дрожжевой дисплей, дрожжевой дисплей малых молекул, дрожжевой дисплей антител и т. д.

Наши библиотеки отображения дрожжей имеют большую емкость и высокое разнообразие, что обеспечивает прочную основу для эффективного скрининга специфических последовательностей антител. Мы можем сконструировать различные формы библиотек отображения дрожжей антител (библиотеки антител IgG, scFv, VHH, Fab), библиотеки белков, библиотеки пептидов, библиотеки кДНК и т. д. в соответствии с вашими потребностями. Кроме того, мы также можем разработать библиотеки антител с различными свойствами, включая иммунные библиотеки, естественные библиотеки, синтетические библиотеки, полусинтетические библиотеки и библиотеки антител к болезням.

Введение в систему отображения дрожжей

Технология отображения поверхности дрожжей — это метод отображения рекомбинантных белков на поверхности дрожжей посредством слияния генов. Наиболее распространенная система отображения дрожжей использует целевой белок, слитый с C-концом субъединицы Aga2p белка спаривания альфа-лектина, в основном состоящий из эпитопных меток с обеих сторон целевого белка: N-концевой 9-аминокислотной метки гемагглютинина (HA) и C-концевой 10-аминокислотной метки c-myc. Субъединица Aga2p из 69 аминокислот связывается с субъединицей Aga1p из 725 аминокислот альфа-лектина посредством двух дисульфидных связей, а Aga1p закреплен на клеточной стенке посредством ковалентной связи β-1,6-глюкана. Таким образом, целевой белок отображается на поверхности дрожжевых клеток и впоследствии распознается соответствующим лигандом. Отделите функциональные белки из библиотек с помощью скрининга проточной цитометрии.

Рис. 1: Принцип отображения поверхности дрожжей. (Источник рисунка:Применение поверхностного дисплея дрожжей для белковой инженерии.)

Введение в библиотеку отображения поверхности дрожжей

Сортировка дрожжевого дисплея основана на дрожжевом поверхностном дисплее, который в основном используется для скрининга библиотек антител, нацеленных на белки клеточной поверхности. Из-за низкого неспецифического связывания между дрожжевыми клетками и другими клеточными поверхностями биологическая селекция дрожжей может скрининговать большие библиотеки связывания для поиска редких клонов.

Служба скрининга библиотеки поверхностного отображения дрожжей

Подготовьте плазмиды и культивируйте дрожжевые клетки, синтезируйте ДНК, кодирующую целевой белок, и клонируйте ее в вектор экспрессии дрожжей, содержащий индуцируемые промоторы, сигнальные пептиды и целевые гены, слитые с поверхностными белками дисплея (такими как Aga2p). Ген, кодирующий целевой белок, можно слить с геном, кодирующим белок клеточной стенки дрожжей (обычно Aga2p), и слитый ген можно трансформировать в дрожжевые клетки посредством электропорации. После трансформации дрожжевые клетки, экспрессирующие гены антител на своей поверхности, можно подвергнуть антигенспецифическим скрининговым тестам: дрожжевая библиотека инкубируется с целевым антигеном, и дрожжевые клетки, которые специфически связываются с ним, отбираются. Используя сортировку клеток с активацией флуоресценции (FACS) для выделения дрожжевых клеток, отображающих белки с желаемыми характеристиками, скрининг библиотеки дисплея дрожжей можно проводить с максимальным размером библиотеки ~10^8-10^9 дрожжевых клеток. Положительные клоны затем можно выделить для дальнейшего анализа или последующих применений. После того, как в библиотеке антител будут идентифицированы специфические клоны антител, их можно дополнительно охарактеризовать, наладить массовое производство и очистить с использованием таких методов, как аффинная хроматография белков A/G, чтобы завершить весь процесс скрининга дрожжей и производства антител.

Процесс скрининга библиотеки дисплеев дрожжей

Рис.2 Процесс скрининга библиотеки дисплеев дрожжей

Рабочий процесс службы скрининга библиотеки дисплеев дрожжей

Шаги	Содержание услуги	Хронология
Приготовление антигена	Тип антигена: Если заказчик может предоставить антигены, соответствующие образцы должны быть доставлены в соответствии с типом: для рекомбинантных белков требуется 3–3,5 мг с требованием чистоты более 85%, для малых молекул необходимо провести конъюгацию с требованием чистоты более 90%, для синтеза пептидов необходимо провести конъюгацию с требованием чистоты более 90%, такие типы образцов, как вирусы, необходимо инактивировать, РНК необходимо проверить для предотвращения деградации, а вышеуказанные типы антигенов также могут быть настроены для синтеза.	2-3 недели
Иммунитет животных	Количество иммунизаций животных составляет 5, и необходимо определить, следует ли увеличить количество иммунизаций на основе тестирования титра сыворотки. Иммунитет к антигенам: активность белкового/вирусного антигена >105; активность пептидного/маломолекулярных антигенов >10^4	5-6 недель
Подготовка шаблона кДНК	Отделить плазматические клетки периферической крови (МПК), извлечь общую РНК (набор для извлечения РНК) и преобразовать в кДНК.	1 день
Строительство библиотеки	Используя библиотеку кДНК в качестве шаблона, ген VHH был амплифицирован двумя раундами ПЦР, и был сконструирован вектор отображения дрожжей сплайсинга гена VHH. Вектор был трансформирован в дрожжевые клетки электропорацией для создания библиотеки антител. Случайным образом выберите 48 клонов и определите положительный показатель (>90%) с помощью метода ПЦР; Рассчитайте емкость библиотеки (10^7-10^8), секвенирование NGS для определения правильного показателя вставки библиотеки (>90%) и разнообразия библиотеки.	2 недели
Проверка библиотеки	По умолчанию три раунда скрининга: флуоресцентно-меченый протеиновый FACS-скрининг, за которым следует секвенирование NGS в третьем раунде. Положительные клоны были отобраны для экспрессии индукции одиночного грамма и обнаружения ELISA. Все положительные клоны были отобраны для секвенирования гена, и были отобраны различные последовательности CDR-регионов.	2-3 недели
Проверка антител	Конструирование соответствующих векторов экспрессии для последовательностей антител может облегчить экспрессию антител, очистку антител, проверку связывания антигена с помощью ИФА и BLI для проверки аффинности антител, а также блокаду проточной цитометрии для проверки функции клеток.	1 неделя

Случай скрининга библиотеки отображения поверхности дрожжей

В литературе о платформе отображения поверхности дрожжей для быстрого обнаружения конформационно селективных нанотел авторы создали полную платформу обнаружения нанотел in vitro на основе отображения поверхности дрожжей. Во-первых, была разработана библиотека синтетических нанотел, начиная с генов верблюда. На рисунке D показано, что нанотело имеет метку HA на карбоксильном конце, а затем нанотело ковалентно фиксируется на стенке клетки дрожжей. На рисунке E показан процесс скрининга нанотел. Дрожжи с антигенным сродством нанотела были выделены, амплифицированы и повторно отобраны для антител с помощью FACS. Авторы обнаружили конформационно селективные нанотела, нацеленные на два разных человеческих GPCR, с помощью этой платформы.