Услуга скрининга образцов поверхности дрожжей в библиотеке образцов.

Наши дрожжевые библиотеки для экспрессии белков обладают большой емкостью и высоким разнообразием, что обеспечивает надежную основу для эффективного скрининга специфических последовательностей антител.

СВЯЗАТЬСЯ С НАМИ

Услуга скрининга образцов поверхности дрожжей в библиотеке образцов.

Компания Alpha Lifetech специализируется на создании библиотек антител методом дрожжевого дисплея и скрининге таких библиотек, предлагая клиентам по всему миру возможность генерировать различные формы дрожжевых библиотек и проводить их скрининг на наличие высокоаффинных и специфических антител. Благодаря команде экспертов-исследователей, передовым технологиям и оборудованию мы можем создавать дрожжевые библиотеки, нацеленные на широкий спектр белков, связанных с заболеваниями. Мы предоставляем технологии фагового и дрожжевого дисплея, включая дрожжевой дисплей белков, дрожжевой дисплей малых молекул, дрожжевой дисплей антител и т.д.

Наши дрожжевые дистрибутивные библиотеки обладают большой емкостью и высоким разнообразием, что обеспечивает прочную основу для эффективного скрининга специфических последовательностей антител. Мы можем создавать различные формы дрожжевых дистрибутивных библиотек антител (IgG, scFv, VHH, Fab-антитела), белковые библиотеки, пептидные библиотеки, кДНК-библиотеки и т.д. в соответствии с вашими потребностями. Кроме того, мы можем разрабатывать библиотеки антител с различными свойствами, включая иммунные библиотеки, природные библиотеки, синтетические библиотеки, полусинтетические библиотеки и библиотеки антител для лечения заболеваний.

Введение в систему отображения дрожжей

Технология поверхностной экспрессии на дрожжах — это метод отображения рекомбинантных белков на поверхности дрожжей посредством слияния генов. Наиболее распространенная система экспрессии на дрожжах использует целевой белок, слитый с С-концом субъединицы Aga2p альфа-лектина, кодирующего белок спаривания, в основном состоящий из эпитопных меток с обеих сторон целевого белка: N-концевой 9-аминокислотной метки гемагглютинина (HA) и C-концевой 10-аминокислотной метки c-myc. 69-аминокислотная субъединица Aga2p связывается с 725-аминокислотной субъединицей альфа-лектина Aga1p посредством двух дисульфидных связей, а Aga1p закрепляется на клеточной стенке посредством ковалентной связи β-1,6-глюкана. Таким образом, целевой белок отображается на поверхности дрожжевых клеток и впоследствии распознается соответствующим лигандом. Функциональные белки из библиотек выделяются с помощью скрининга методом проточной цитометрии.

Рис. 1: Принцип отображения поверхности дрожжей. (Источник рисунка: Применение метода поверхностного отображения на дрожжах для белковой инженерии.)

Введение в библиотеку отображения поверхности дрожжей

Метод дрожжевой экспрессии основан на поверхностной экспрессии дрожжей и в основном используется для скрининга библиотек антител, нацеленных на белки клеточной поверхности. Благодаря низкой неспецифической связи между дрожжевыми клетками и другими клеточными поверхностями, биологическая селекция дрожжей позволяет проводить скрининг больших библиотек связывания для поиска редких клонов.

Услуга скрининга образцов поверхности дрожжей в библиотеке образцов.

Подготовьте плазмиды и культивируйте дрожжевые клетки, синтезируйте ДНК, кодирующую целевой белок, и клонируйте ее в дрожжевой экспрессионный вектор, содержащий индуцируемые промоторы, сигнальные пептиды и целевые гены, слитые с белками поверхностной экспрессии (например, Aga2p). Ген, кодирующий целевой белок, может быть слит с геном, кодирующим белок клеточной стенки дрожжей (обычно Aga2p), и слитый ген может быть трансформирован в дрожжевые клетки посредством электропорации. После трансформации дрожжевые клетки, экспрессирующие гены антител на своей поверхности, могут пройти антиген-специфические скрининговые тесты: дрожжевая библиотека инкубируется с целевым антигеном, и отбираются дрожжевые клетки, которые специфически связываются с ним. Используя флуоресцентную проточную цитометрию (FACS) для выделения дрожжевых клеток, экспрессирующих белки с желаемыми характеристиками, можно провести скрининг дрожжевой библиотеки экспрессии с максимальным размером библиотеки ~10⁸-10⁹ дрожжевых клеток. Положительные клоны затем могут быть выделены для дальнейшего анализа или последующих применений. После идентификации специфических клонов антител в библиотеке антител их можно дополнительно охарактеризовать, наладить массовое производство и очистить с помощью таких методов, как аффинная хроматография на белке A/G, чтобы завершить весь процесс скрининга с использованием дрожжевого дисплея и производства антител.

Процесс скрининга библиотеки дрожжевых дисплеев

Рис. 2. Процесс скрининга библиотеки дрожжевых дисплеев.

Рабочий процесс службы скрининга образцов дрожжей в библиотеке для демонстрации результатов экспериментов.

Шаги	Содержание сервиса	Хронология
Подготовка антигена	Тип антигена: Если заказчик может предоставить антигены, необходимо предоставить соответствующие образцы в зависимости от типа: для рекомбинантных белков требуется 3-3,5 мг с требованием чистоты более 85%, для конъюгации малых молекул — с требованием чистоты более 90%, для синтеза пептидов — с требованием чистоты более 90%, для таких типов образцов, как вирусы, — инактивированные образцы, для РНК — образцы, прошедшие проверку на предотвращение деградации; вышеперечисленные типы антигенов также могут быть синтезированы по индивидуальному заказу.	2-3 недели
Иммунитет животных	Количество прививок животным составляет 5, и необходимо определить, следует ли увеличить количество прививок на основе анализа титра сыворотки. Антигенный иммунитет: активность белкового/вирусного антигена > 10⁵; активность пептидного/маломолекулярного антигена > 10⁴	5-6 недель
Подготовка кДНК-шаблона	Отделите плазму периферических мононуклеарных клеток (PBMC), выделите общую РНК (с помощью набора для выделения РНК) и преобразуйте ее в кДНК.	1 день
Строительство библиотеки	Используя кДНК библиотеки в качестве матрицы, ген VHH был амплифицирован в два раунда ПЦР, и был сконструирован вектор для дрожжевой экспрессии гена VHH. Вектор был трансформирован в дрожжевые клетки методом электропорации для создания библиотеки антител. Случайным образом были отобраны 48 клонов, и определена доля положительных результатов (>90%) с помощью метода ПЦР; рассчитана емкость библиотеки (10^7-10^8), проведено секвенирование NGS для определения доли правильных вставок в библиотеку (>90%) и разнообразия библиотеки.	2 недели
Библиотечный показ	Стандартная трехэтапная процедура скрининга: скрининг с использованием флуоресцентно меченых белков методом FACS, за которым следует секвенирование NGS на третьем этапе. Положительные клоны отбирались для индукции экспрессии в 1 грамме и обнаружения методом ELISA. Все положительные клоны отбирались для секвенирования генов, при этом выбирались последовательности различных CDR-регионов.	2-3 недели
Проверка антител	Создание соответствующих экспрессионных векторов для последовательностей антител может облегчить экспрессию антител, их очистку, валидацию связывания антител с антигеном с помощью ИФА и БЛИ для проверки аффинности антител, а также блокирование методом проточной цитометрии для подтверждения функции клеток.	1 неделя

Пример скрининга библиотеки поверхностного дисплея дрожжей

В литературе, посвященной платформе поверхностного отображения на дрожжах для быстрого обнаружения конформационно-селективных наноантител, авторы разработали полноценную платформу для обнаружения наноантител in vitro на основе поверхностного отображения на дрожжах. Сначала была создана библиотека синтетических наноантител, начиная с генов верблюда. На рисунке D показано, что наноантитело имеет метку HA на карбоксильном конце, после чего наноантитело ковалентно закрепляется на клеточной стенке дрожжей. На рисунке E показан процесс скрининга наноантител. Дрожжи с антигенной аффинностью наноантител были выделены, амплифицированы и многократно отобраны для получения антител методом FACS. С помощью этой платформы авторы обнаружили конформационно-селективные наноантитела, нацеленные на два разных человеческих GPCR.