Čo je to protilátkové inžinierstvo?

Pomocou protilátkového inžinierstva bolo možné modifikovať molekulovú veľkosť, farmakokinetiku, imunogenicitu, väzbovú afinitu, špecifickosť a efektorovú funkciu protilátok. Po syntéze protilátok ich špecifická väzba robí vysoko hodnotnými v klinickej diagnostike a liečbe. Prostredníctvom protilátkového inžinierstva môžu spĺňať potreby včasného vývoja liekov a diagnostiky.

Účelom protilátkového inžinierstva je navrhnúť a vytvoriť vysoko špecifické, stabilné funkcie, ktoré prirodzené protilátky nedokážu dosiahnuť, čím sa položí základ pre produkciu terapeutických protilátok.

Alpha Lifetech so svojimi rozsiahlymi projektovými skúsenosťami v oblasti protilátkového inžinierstva môže poskytnúť prispôsobené služby monoklonálnych a polyklonálnych protilátok pre viaceré druhy, ako aj služby konštrukcie knižníc protilátok na fágovom displeji a skríningové služby. Alpha Lifetech môže zákazníkom poskytnúť kvalitné biosimilárne protilátky a rekombinantné proteínové produkty, ako aj zodpovedajúce služby na výrobu účinných, vysoko špecifických a stabilných protilátok. Využitím komplexných protilátkových, proteínových platforiem a fágových zobrazovacích systémov poskytujeme služby pokrývajúce upstream a downstream produkcie protilátok, vrátane technických služieb, ako je humanizácia protilátok, purifikácia protilátok, sekvenovanie protilátok a validácia protilátok.

Priekopnícke štádium protilátkového inžinierstva súvisí s dvoma technológiami:

-- Technológia rekombinantnej DNA

-- Hybridómová technológia

Rýchly rozvoj protilátkového inžinierstva súvisí s tromi dôležitými technológiami:

-- Technológia klonovania génov a polymerázová reťazová reakcia

-- Expresia proteínov: Rekombinantné proteíny sú produkované expresnými systémami, ako sú kvasinky, tyčinkovité vírusy a rastliny

--Počítačom podporovaný konštrukčný návrh

Prvá generácia protilátok bola humanizovaná na produkciu chimérických protilátok, kde bola variabilná oblasť myších monoklonálnych protilátok spojená s konštantnou oblasťou molekúl ľudského IgG. Oblasť viažuca antigén (CDR) myšej monoklonálnej protilátky druhej generácie bola transplantovaná do ľudského IgG. Okrem oblasti CDR sú všetky ostatné protilátky takmer ľudskými protilátkami a pri použití myších klonových protilátok na ľudskú liečbu sa vynaložilo úsilie vyhnúť sa vyvolaniu reakcií ľudských protilátok proti myšiam (HAMA).

 

Na zostavenie knižnice fágového displeja je prvým krokom získanie génov kódujúcich protilátky, ktoré možno izolovať z B buniek imunizovaných zvierat (konštrukcia imunitnej knižnice), extrahovať priamo z neimunizovaných zvierat (konštrukcia prirodzenej knižnice) alebo dokonca zostaviť in vitro s fragmentmi génu protilátky (konštrukcia syntetickej knižnice). Potom sú gény amplifikované pomocou PCR, vložené do plazmidov a exprimované vo vhodných hostiteľských systémoch (expresia kvasiniek (zvyčajne Pichia pastoris), prokaryotická expresia (zvyčajne E. coli), expresia v cicavčích bunkách, expresia v rastlinných bunkách a expresia hmyzích buniek infikovaných tyčinkovitými vírusmi). Najbežnejší je expresný systém E. coli, ktorý integruje špecifickú kódujúcu protilátkovú sekvenciu na fág a kóduje jeden z proteínov obalu fága (pIII alebo pVIII). Génová fúzia A zobrazená na povrchu bakteriofágov. Jadrom tejto technológie je skonštruovať knižnicu fágového displeja, ktorá má výhodu oproti prirodzeným knižniciam v tom, že môže mať špecifickú väzbu. Následne sú protilátky s antigénovou špecifickosťou skrínované procesom biologickej selekcie, cieľové antigény sú fixované, nenaviazané fágy sú opakovane vymývané a naviazané fágy sú vymývané pre ďalšie obohatenie. Po troch alebo viacerých kolách opakovania sa izolujú protilátky s vysokou špecifickosťou a vysokou afinitou.

Obr. 3: Konštrukcia knižnice protilátok a skríning

Na generovanie fragmentov protilátok možno použiť technológiu rekombinantnej DNA. Fab protilátky môžu byť spočiatku hydrolyzované iba žalúdočnou proteázou za vzniku (Fab')2 fragmentov, ktoré sú potom štiepené papaínom za vzniku individuálnych Fab fragmentov. Fragment Fv pozostáva z VH a VL, ktoré majú slabú stabilitu v dôsledku absencie disulfidových väzieb. Preto sú VH a VL spolu spojené prostredníctvom krátkeho peptidu s 15-20 aminokyselinami za vzniku protilátky s jednoreťazcovým variabilným fragmentom (scFv) s molekulovou hmotnosťou približne 25 kDa.

Štúdia štruktúry protilátok u Camelidae (Camel, LIama a Alpaca) objasnila, že protilátky majú iba ťažké reťazce a žiadne ľahké reťazce, preto sa nazývajú protilátky s ťažkým reťazcom (hcAb). Variabilná doména protilátok ťažkého reťazca sa nazýva jednodoménové protilátky alebo nanobody alebo VHH s veľkosťou 12-15 kDa. Ako monoméry nemajú disulfidové väzby a sú veľmi stabilné, s veľmi vysokou afinitou k antigénom.

Obr. 5: Protilátka s ťažkým reťazcom a VHH/nanoprotilátka

Bezbunková expresia využíva expresiu prirodzenej alebo syntetickej DNA na dosiahnutie in vitro proteínovej syntézy, typicky s použitím expresného systému E. coli. Produkuje proteíny rýchlo a zabraňuje metabolickej a cytotoxickej záťaži buniek pri produkcii veľkého množstva rekombinantných proteínov in vivo. Môže tiež produkovať proteíny, ktoré sa ťažko syntetizujú, ako napríklad tie, ktoré sa ťažko modifikujú po translácii alebo syntetizujú membránové proteíny.