Čo je protilátkové inžinierstvo?

Pomocou protilátkového inžinierstva bolo možné modifikovať molekulovú veľkosť, farmakokinetiku, imunogenicitu, väzbovú afinitu, špecificitu a efektorovú funkciu protilátok. Po syntéze protilátok ich špecifická väzba robí veľmi cennými v klinickej diagnostike a liečbe. Prostredníctvom protilátkového inžinierstva môžu spĺňať potreby včasného vývoja liekov a diagnostiky.

Účelom protilátkového inžinierstva je navrhnúť a vytvoriť vysoko špecifické, stabilné funkcie, ktoré prirodzené protilátky nedokážu dosiahnuť, a položiť tak základy pre produkciu terapeutických protilátok.

Spoločnosť Alpha Lifetech, s rozsiahlymi skúsenosťami v oblasti projektového inžinierstva protilátok, dokáže poskytnúť prispôsobené služby v oblasti monoklonálnych a polyklonálnych protilátok pre viacero druhov, ako aj služby v oblasti konštrukcie a skríningu knižníc protilátok pre fágový displej. Spoločnosť Alpha Lifetech môže zákazníkom poskytnúť kvalitné biosimilárne protilátky a rekombinantné proteínové produkty, ako aj zodpovedajúce služby na produkciu účinných, vysoko špecifických a stabilných protilátok. Využívaním komplexných platforiem protilátok a proteínov a systémov fágového displeja poskytujeme služby pokrývajúce predchádzajúcu aj následnú fázu produkcie protilátok vrátane technických služieb, ako je humanizácia protilátok, purifikácia protilátok, sekvenovanie protilátok a validácia protilátok.

Priekopnícka fáza inžinierstva protilátok súvisí s dvoma technológiami:

--Technológia rekombinantnej DNA

--Hybridómová technológia

Rýchly rozvoj protilátkového inžinierstva súvisí s tromi dôležitými technológiami:

--Technológia klonovania génov a polymerázová reťazová reakcia

--Expresia proteínov: Rekombinantné proteíny sú produkované expresnými systémami, ako sú kvasinky, tyčinkovité vírusy a rastliny

--Počítačom podporovaný konštrukčný návrh

Prvá generácia protilátok bola humanizovaná na produkciu chimérických protilátok, kde variabilná oblasť myších monoklonálnych protilátok bola spojená s konštantnou oblasťou molekúl ľudského IgG. Oblasť viažuca antigén (CDR) myšej monoklonálnej protilátky druhej generácie bola transplantovaná do ľudského IgG. Okrem oblasti CDR sú všetky ostatné protilátky takmer ľudské protilátky a vynaložilo sa úsilie, aby sa zabránilo indukcii ľudských antimyších protilátkových reakcií (HAMA) pri použití myších klonovaných protilátok na liečbu ľudí.

 

Pri konštrukcii fágovej zobrazovacej knižnice je prvým krokom získanie génov kódujúcich protilátky, ktoré je možné izolovať z B buniek imunizovaných zvierat (konštrukcia imunitnej knižnice), extrahovať priamo z neimunizovaných zvierat (konštrukcia prirodzenej knižnice) alebo dokonca zostaviť in vitro s fragmentmi génov protilátok (konštrukcia syntetickej knižnice). Potom sa gény amplifikujú pomocou PCR, vložia do plazmidov a exprimujú vo vhodných hostiteľských systémoch (expresia v kvasinkách (zvyčajne Pichia pastoris), prokaryotická expresia (zvyčajne E. coli), expresia v cicavčích bunkách, expresia v rastlinných bunkách a expresia v hmyzích bunkách infikovaných tyčinkovitými vírusmi). Najbežnejší je expresný systém E. coli, ktorý integruje špecifickú kódujúcu sekvenciu protilátok do fágu a kóduje jeden z proteínov fágového obalu (pIII alebo pVIII). Génová fúzia , A a je zobrazená na povrchu bakteriofágov. Jadrom tejto technológie je konštrukcia fágovej zobrazovacej knižnice, ktorá má oproti prirodzeným knižniciam výhodu v tom, že sa môže špecificky viazať. Následne sa protilátky s antigénovou špecifickosťou skrínujú prostredníctvom biologického selekčného procesu, cieľové antigény sa fixujú, neviazané fágy sa opakovane vymývajú a viazané fágy sa vymývajú na ďalšie obohatenie. Po troch alebo viacerých kolách opakovania sa izolujú protilátky s vysokou špecifickosťou a vysokou afinitou.

Obr. 3: Konštrukcia a skríning knižnice protilátok

Na generovanie fragmentov protilátok možno použiť technológiu rekombinantnej DNA. Protilátky Fab môžu byť spočiatku hydrolyzované iba žalúdočnou proteázou za vzniku fragmentov (Fab')2, ktoré sú potom štiepené papaínom za vzniku jednotlivých fragmentov Fab. Fragment Fv pozostáva z VH a VL, ktoré majú nízku stabilitu kvôli absencii disulfidových väzieb. Preto sú VH a VL spojené krátkym peptidom s 15 – 20 aminokyselinami a tvoria protilátku s jednoreťazcovým variabilným fragmentom (scFv) s molekulovou hmotnosťou približne 25 KDa.

Štúdia štruktúry protilátok u čeľade Camelidae (ťava, ľalia a alpaka) objasnila, že protilátky majú iba ťažké reťazce a žiadne ľahké reťazce, preto sa nazývajú protilátky s ťažkým reťazcom (hcAb). Variabilná doména protilátok s ťažkým reťazcom sa nazýva jednodoménové protilátky alebo nanotelieska alebo VHH s veľkosťou 12 – 15 kDa. Ako monoméry nemajú disulfidové väzby a sú veľmi stabilné s veľmi vysokou afinitou k antigénom.

Obr. 5: Protilátka ťažkého reťazca a VHH/nanobody

Voľnobunková expresia využíva expresiu prirodzenej alebo syntetickej DNA na dosiahnutie syntézy proteínov in vitro, typicky s použitím expresného systému E. coli. Produkuje proteíny rýchlo a pri produkcii veľkého množstva rekombinantných proteínov in vivo sa vyhýba metabolickej a cytotoxickej záťaži buniek. Môže tiež produkovať proteíny, ktoré sa ťažko syntetizujú, napríklad tie, ktoré sa ťažko modifikujú po translácii alebo syntetizujú membránové proteíny.