Kaj je inženiring protiteles?

S pomočjo inženiringa protiteles je bilo mogoče spremeniti molekularno velikost, farmakokinetiko, imunogenost, vezavno afiniteto, specifičnost in efektorsko funkcijo protiteles. Po sintezi protiteles jih specifična vezava naredi zelo dragocena v klinični diagnozi in zdravljenju. Z inženiringom protiteles lahko zadostijo potrebam zgodnjega razvoja zdravil in diagnostike.

Namen inženiringa protiteles je zasnova in izdelava visoko specifičnih, stabilnih funkcij, ki jih naravna protitelesa ne morejo doseči, s čimer se postavijo temelji za proizvodnjo terapevtskih protiteles.

Alpha Lifetech z bogatimi izkušnjami na področju projektnega inženiringa protiteles lahko nudi prilagojene storitve monoklonskih in poliklonskih protiteles za več vrst, kot tudi storitve izdelave knjižnic protiteles za fagni prikaz in presejanja. Alpha Lifetech lahko strankam zagotovi kakovostna biološko podobna protitelesa in rekombinantne beljakovinske izdelke ter ustrezne storitve za proizvodnjo učinkovitih, visoko specifičnih in stabilnih protiteles. Z uporabo celovitih platform za protitelesa in beljakovine ter sistemov za fagni prikaz nudimo storitve, ki pokrivajo pred in po proizvodnji protiteles, vključno s tehničnimi storitvami, kot so humanizacija protiteles, čiščenje protiteles, sekvenciranje protiteles in validacija protiteles.

Pionirska faza inženiringa protiteles je povezana z dvema tehnologijama:

--Tehnologija rekombinantne DNK

--Hibridomska tehnologija

Hiter razvoj inženiringa protiteles je povezan s tremi pomembnimi tehnologijami:

--Tehnologija kloniranja genov in verižna reakcija s polimerazo

--Izražanje beljakovin: Rekombinantne beljakovine proizvajajo ekspresijski sistemi, kot so kvasovke, paličasti virusi in rastline

--Računalniško podprto strukturno načrtovanje

Prva generacija protiteles je bila humanizirana za proizvodnjo himernih protiteles, kjer je bila variabilna regija mišjih monoklonskih protiteles povezana s konstantno regijo molekul človeškega IgG. Vezavna regija za antigen (CDR) mišjega monoklonskega protitelesa druge generacije je bila presajena v človeški IgG. Razen regije CDR so vsa druga protitelesa skoraj človeška protitelesa, zato so si prizadevali preprečiti indukcijo odzivov človeških protiteles proti mišjemu miši (HAMA) pri uporabi mišjih klonskih protiteles za zdravljenje ljudi.

 

Za izgradnjo knjižnice fagnega prikaza je prvi korak pridobitev genov, ki kodirajo protitelesa, ki jih je mogoče izolirati iz celic B imuniziranih živali (izgradnja imunske knjižnice), ekstrahirati neposredno iz neimuniziranih živali (izgradnja naravne knjižnice) ali celo sestaviti in vitro s fragmenti genov protiteles (izgradnja sintetične knjižnice). Nato se geni pomnožijo s PCR, vstavijo v plazmide in izrazijo v ustreznih gostiteljskih sistemih (ekspresija kvasovk (običajno Pichia pastoris), prokariontska ekspresija (običajno E. coli), ekspresija sesalskih celic, ekspresija rastlinskih celic in ekspresija žuželčnih celic, okuženih s paličastimi virusi). Najpogostejši je ekspresijski sistem E. coli, ki integrira specifično kodirajoče zaporedje protiteles na fag in kodira enega od proteinov fagne lupine (pIII ali pVIII). Genska fuzija , in prikazana na površini bakteriofagov. Jedro te tehnologije je izgradnja knjižnice fagnega prikaza, ki ima prednost pred naravnimi knjižnicami, saj se lahko specifično veže. Nato se protitelesa z antigensko specifičnostjo pregledajo s postopkom biološke selekcije, ciljni antigeni se fiksirajo, nevezani fagi se večkrat sperejo, vezani fagi pa se sperejo za nadaljnjo obogatitev. Po treh ali več krogih ponovitve se izolirajo protitelesa z visoko specifičnostjo in visoko afiniteto.

Slika 3: Konstrukcija in presejanje knjižnice protiteles

Za ustvarjanje fragmentov protiteles se lahko uporabi tehnologija rekombinantne DNK. Protitelesa Fab lahko sprva hidrolizira le želodčna proteaza, da nastanejo fragmenti (Fab')2, ki jih nato prebavi papain, da nastanejo posamezni fragmenti Fab. Fragment Fv je sestavljen iz VH in VL, ki imata slabo stabilnost zaradi odsotnosti disulfidnih vezi. Zato sta VH in VL povezana s kratkim peptidom, dolgim ​​15–20 aminokislin, in tvorita protitelo z enoverižnim variabilnim fragmentom (scFv) z molekulsko maso približno 25 KDa.

Študija strukture protiteles pri družini Camelidae (Camel, Liama ​​in Alpaca) je pojasnila, da imajo protitelesa samo težke verige in ne lahkih verig, zato se imenujejo protitelesa s težko verigo (hcAb). Variabilna domena protiteles s težko verigo se imenuje protitelesa z eno domeno ali nanotelesa ali VHH, z velikostjo 12–15 kDa. Kot monomeri nimajo disulfidnih vezi in so zelo stabilni, z zelo visoko afiniteto za antigene.

Slika 5: Protitelo težke verige in VHH/nanotelo

Prostocelična ekspresija uporablja ekspresijo naravne ali sintetične DNK za doseganje sinteze beljakovin in vitro, običajno z uporabo ekspresijskega sistema E. coli. Hitro proizvaja beljakovine in se izogne ​​presnovni in citotoksični obremenitvi celic pri proizvodnji velikih količin rekombinantnih beljakovin in vivo. Lahko proizvaja tudi beljakovine, ki jih je težko sintetizirati, na primer tiste, ki jih je težko modificirati po translaciji ali sintetizirati membranske beljakovine.