Kaj je inženiring protiteles?

S pomočjo inženiringa protiteles je bilo mogoče spremeniti velikost molekule, farmakokinetiko, imunogenost, vezavno afiniteto, specifičnost in efektorsko funkcijo protiteles. Po sintezi protiteles je specifična vezava protiteles zelo dragocena pri klinični diagnostiki in zdravljenju. Z inženiringom protiteles lahko zadostijo potrebam zgodnjega razvoja zdravil in diagnostike.

Namen inženiringa protiteles je oblikovati in izdelati zelo specifične, stabilne funkcije, ki jih naravna protitelesa ne morejo doseči, in postaviti temelje za proizvodnjo terapevtskih protiteles.

Alpha Lifetech lahko s svojimi obsežnimi projektnimi izkušnjami na področju inženiringa protiteles zagotovi prilagojene storitve monoklonskih in poliklonskih protiteles za več vrst, kot tudi gradnjo knjižnice protiteles s prikazom fagov in storitve presejanja. Alpha Lifetech lahko strankam zagotovi kakovostna biološko podobna protitelesa in rekombinantne beljakovinske izdelke ter ustrezne storitve za proizvodnjo učinkovitih, zelo specifičnih in stabilnih protiteles. Z uporabo celovitih platform za protitelesa, beljakovine in sisteme za prikazovanje fagov zagotavljamo storitve, ki pokrivajo proizvodnjo protiteles navzgor in navzdol, vključno s tehničnimi storitvami, kot so humanizacija protiteles, čiščenje protiteles, sekvenciranje protiteles in validacija protiteles.

Pionirska stopnja inženirstva protiteles je povezana z dvema tehnologijama:

--Tehnologija rekombinantne DNK

--Hybridoma tehnologija

Hiter razvoj inženiringa protiteles je povezan s tremi pomembnimi tehnologijami:

--Tehnologija kloniranja genov in verižna reakcija s polimerazo

-- Ekspresija beljakovin: rekombinantne beljakovine proizvajajo ekspresijski sistemi, kot so kvasovke, paličasti virusi in rastline.

--Računalniško podprto konstrukcijsko načrtovanje

Prva generacija protiteles je bila humanizirana za proizvodnjo himernih protiteles, kjer je bila variabilna regija mišjih monoklonskih protiteles povezana s konstantno regijo človeških molekul IgG. Antigen vezavno regijo (CDR) druge generacije mišjega monoklonskega protitelesa smo presadili v človeški IgG. Razen regije CDR so vsa druga protitelesa skoraj človeška protitelesa, zato so se trudili, da bi se izognili odzivom na človeška protitelesa proti mišjim protitelesom (HAMA) pri uporabi protiteles proti mišjim klonom za zdravljenje ljudi.

 

Za izdelavo knjižnice fagnega prikaza je prvi korak pridobivanje genov, ki kodirajo protitelesa, ki jih je mogoče izolirati iz celic B imuniziranih živali (konstrukcija imunske knjižnice), ekstrahirati neposredno iz neimuniziranih živali (konstrukcija naravne knjižnice) ali celo sestaviti in vitro z genskimi fragmenti protiteles (konstrukcija sintetične knjižnice). Nato se geni pomnožijo s PCR, vstavijo v plazmide in izrazijo v ustreznih gostiteljskih sistemih (ekspresija kvasovk (običajno Pichia pastoris), prokariontska ekspresija (običajno E. coli), ekspresija celic sesalcev, ekspresija rastlinskih celic in ekspresija celic žuželk, okuženih s paličastimi virusi). Najpogostejši je ekspresijski sistem E. coli, ki integrira specifično kodirno zaporedje protiteles na fag in kodira enega od proteinov lupine faga (pIII ali pVIII). Fuzija genov, in prikazana na površini bakteriofagov. Jedro te tehnologije je izdelava knjižnice za prikaz fagov, ki ima prednost pred naravnimi knjižnicami v tem, da ima lahko specifično vezavo. Nato se protitelesa z antigensko specifičnostjo pregledajo s postopkom biološke selekcije, ciljni antigeni se fiksirajo, nevezani fagi se večkrat sperejo, vezani fagi pa se sperejo za nadaljnjo obogatitev. Po treh ali več krogih ponavljanja se izolirajo protitelesa z visoko specifičnostjo in visoko afiniteto.

Slika 3: Konstrukcija in presejanje knjižnice protiteles

Tehnologijo rekombinantne DNA je mogoče uporabiti za ustvarjanje fragmentov protiteles. Protitelesa Fab lahko na začetku samo hidrolizira želodčna proteaza, da proizvedejo fragmente (Fab ') 2, ki jih nato prebavi papain, da ustvari posamezne fragmente Fab. Fv fragment je sestavljen iz VH in VL, ki imata slabo stabilnost zaradi odsotnosti disulfidnih vezi. Zato sta VH in VL povezana skupaj s kratkim peptidom iz 15-20 aminokislin, da tvorita protitelo z enojno verigo variabilnega fragmenta (scFv) z molekulsko maso približno 25 kDa.

Študija strukture protiteles pri Camelidae (Camel, LIama in Alpaca) je razjasnila, da imajo protitelesa le težke verige in nimajo lahkih verig, zato jih imenujemo protitelesa težke verige (hcAb). Variabilna domena protiteles težke verige se imenuje enodomenska protitelesa ali nanotelesa ali VHH, z velikostjo 12-15 kDa. Kot monomeri nimajo disulfidnih vezi in so zelo stabilni, z zelo visoko afiniteto do antigenov.

Slika 5: Protitelesa za težko verigo in VHH/nanotelesa

Ekspresija brez celic uporablja ekspresijo naravne ali sintetične DNA za doseganje in vitro sinteze beljakovin, običajno z uporabo ekspresijskega sistema E. coli. Hitro proizvaja beljakovine in se izogiba presnovni in citotoksični obremenitvi celic pri proizvodnji velikih količin rekombinantnih beljakovin in vivo. Lahko proizvaja tudi beljakovine, ki jih je težko sintetizirati, na primer tiste, ki jih je težko spremeniti po prevodu, ali sintetizira membranske beljakovine.