Storitev analize karakterizacije aptamerjev

Alpha Lifetech že vrsto let zagotavlja storitve, povezane z aptameri, in trenutno lahko ponudi celovite sheme za razvoj aptamerjev, kot so sinteza aptamerjev, presejanje SELEX, visokozmogljivo sekvenciranje ter optimizacija in karakterizacija aptamerjev. Na podlagi prednosti metode SELEX za presejanje aptamerjev je Alpha Lifetech razširil še več metod za presejanje aptamerjev.

Uvod v analizo karakterizacije aptamerjev

Preverjanje afinitete

Optimizirana afiniteta aptamera je bila preverjena z ustreznimi tehnikami testa vezave aptamera. Primeri vključujejo izotermno titracijsko kalorimetrijo (ITC), pretočno citometrijo (FCM) in površinsko plazmonsko resonanco (SPR), mikrofluidiko itd. Afiniteta aptamera se običajno izraža z disociacijsko konstanto (KD), fizikalno količino, ki se uporablja za kvantificiranje stopnje molekularne disociacije v reverzibilni reakciji. Manjša kot je vrednost KD, bolj stabilen je kompleks, torej močnejša je afiniteta; obratno, večja kot je vrednost KD, bolj nestabilen je kompleks in šibkejša je afiniteta. Ta korak je ključnega pomena za identifikacijo delovanja aptamera, saj zagotavlja zorenje afinitete aptamera in se lahko veže na ciljno molekulo z visoko afiniteto in selektivnostjo v praktični uporabi.

Slika 1 Postopek zorenja afinitete aptamera. Vir:Kinghorn AB, Fraser LA, 2017.

Preverjanje funkcije

Poleg preverjanja afinitete je treba preveriti tudi delovanje aptamera. To vključuje preverjanje stabilnosti, specifičnosti in interakcij aptamera z drugimi molekulami v določenem okolju. Rezultati preverjanja funkcionalnosti bodo neposredno vplivali na vrednost aptamerjev v znanstvenih raziskavah in industrijskih aplikacijah.

Specifično preverjanje

Konkurenčni poskus: Sposobnost aptamera, da se veže na specifično tarčo, se oceni v prisotnosti drugih podobnih tarč. Če se aptamer lahko specifično veže na ciljno molekulo brez motenj drugih molekul, to kaže na njegovo visoko specifičnost.

Poskus navzkrižne reakcije: Aptamer se veže na vrsto sorodnih ali nepovezanih tarč, da se preveri, ali se veže le na določeno tarčo, s čimer se preveri njegova specifičnost.

Preverjanje stabilnosti

Poskus razgradnje nukleaz: Aptamerje smo izpostavili različnim koncentracijam nukleaz in opazovali njihovo razgradnjo. S primerjavo stopnje razgradnje v različnih časovnih točkah je mogoče oceniti sposobnost aptamera za razgradnjo antinukleaz.

Poskus temperaturne in časovne stabilnosti: Aptamer je bil postavljen v različne temperaturne in časovne pogoje, da bi opazovali njegovo strukturno in funkcionalno stabilnost. To pomaga določiti optimalne pogoje shranjevanja in uporabe aptamerjev.

Identifikacija biološke aktivnosti

Ustrezna metoda se običajno izbere glede na specifični cilj uporabe aptamera nukleinske kisline.

(1) Testiranje na molekularni ravni: Uporaba tehnik molekularne biologije, kot so gelska elektroforeza, Western blot itd., za odkrivanje kompleksov, ki nastanejo po združitvi aptamera s ciljno molekulo, ali za odkrivanje sprememb v ravni izražanja ciljne molekule, ki jih povzroča aptamer.

(2) Testiranje na ravni celic: Z uporabo tehnologije celičnih kultur se aptameri inkubirajo s ciljnimi celicami, da se opazujejo biološke spremembe, kot so celična morfologija, proliferacija in apoptoza, ter oceni biološka aktivnost aptamerjev.

(3) Testiranje na živalskih modelih: V ustreznih živalskih modelih se aptameri nukleinskih kislin dajejo z injekcijo ali dajanjem zdravil, fiziološki kazalniki in patološke spremembe živali pa se opazujejo za oceno biološke aktivnosti in varnosti aptamerjev in vivo.