Storitev za razvoj monoklonskih protiteles

Alpha Lifetech Inc.lahko zagotovi napoved epitopov, sintezo peptidov, izražanje beljakovin, proizvodnjo poliklonskih ali monoklonskih protiteles, kot tudi čiščenje protiteles iz celične kulture, ascitesne tekočine ali celotnega seruma.

Alpha Lifetech Inc.ima izkušnje z zagotavljanjem različnih storitev za stabilne celične linije strankam, vključno s hibridomskimi celicami, celičnimi linijami za urejanje genoma, celičnimi linijami z izničenjem in celičnimi linijami s prekomerno ekspresijo. Vsaki stranki se trudimo ponuditi napredne storitve celičnih linij po meri, naše storitve pa so preizkušene in zaupanja vredne.

Strategija razvoja protiteles

1. Načrtovanje in priprava antigena
Ti antigeni so lahko beljakovine, peptidi ali druge molekule. Oblikovanje imunogenov zahteva celovit pristop, ki združuje znanje o strukturi antigenov, imunologiji in sistemih za dajanje. Alpha Lifetech ima tehnologijo oblikovanja antigenov, ki lahko oblikuje imunogene za stranke, ki jo potrebujejo.
Alpha Lifetech ponuja rekombinantne beljakovinske izdelke, med katerimi lahko stranke izbirajo. Imamo različne sisteme za izražanje beljakovin, kot so ekspresijski sistem E. coli, ekspresijski sistem kvasovk, ekspresijski sistem bakulovirusov in žuželk, ekspresijski sistem sesalcev itd., za proizvodnjo rekombinantnih beljakovin, ki jih potrebujete za raziskave.

2. Imunizacija živali
Alpha Lifetech lahko strankam zagotovi imunogene, na voljo pa so vam tudi imune živali, kot so miši, kunci, ovce, alpake, morski prašički, hrčki itd.

3. Metode za proizvodnjo monoklonskih protiteles

●Proizvodnja monoklonskih antitikel (MAB) s hibridomsko tehnologijo
Hibridom je hibridna celica, ki nastane z zlitjem dveh vrst celic, in sicer mišje mielomske celične linije in plazemskih celic (limfocit B), pri čemer lahko heterozigotna celica in vitro proizvaja neprekinjena protitelesa proti antigenu, ki nas zanima. Proizvodnja hibridomske celične linije je sestavljena iz treh delov: načrtovanja antigena (hapteni, majhne molekule in peptidi), imunizacije živali, celične fuzije in pozitivnega kloniranja. Z uporabo edinstvenih metodologij imunizacije dosegamo izjemno visoko učinkovitost celične fuzije (1–10 hibridomov na tisoč celic B) in visoke titre protiteles, kar maksimizira našo stopnjo uspešnosti v nadaljnjih analitičnih testih, ki vključujejo biokemijsko presejanje, in vitro celične teste in študije na živalih.

●Proizvodnja monoklonskih protiteles s tehnologijo fagnega prikaza
Fagni prikaz ponuja še eno metodo za ustvarjanje monoklonskih protiteles. B-limfocite izoliramo iz živalske krvi in ekstrahiramo njihovo mRNA. S PCR se ta mRNA pretvori v cDNA, ki pomnoži vse segmente VH in VL. Ti segmenti se nato klonirajo v vektor, običajno kot enoverižni variabilni fragmenti (scFv), skupaj z beljakovino PIII bakteriofaga. Nato se ta konstrukt uporabi za okužbo E. coli, kar povzroči nastanek knjižnice, ki vsebuje približno 10^10 celic z inokulacijo s pomožnim fagom. E. coli nato lahko izloči bakteriofag, ki vsebuje segmente VH in VL kot del svoje ovojnice. Nato se lahko izberejo specifični segmenti VH in VL, ki ciljajo na antigen, ki nas zanima, in se uporabijo za ponovno inokulacijo E. coli z bakteriofagom. Celice, ki vsebujejo plazmid, se nato izolirajo in sekvencirajo.

4. Fuzijski presejalni test

●Zlitje in selekcija celic
Pridobljene celice B se nato združijo z mielomskimi celicami, ki so rakave celice, ki se lahko v kulturi razmnožujejo v nedogled. Zlitje se običajno doseže s tehniko, kot je zlitje s polietilen glikolom (PEG).
Po fuziji se hibridomske celice gojijo v selektivnem gojišču, ki omogoča preživetje le hibridomom. Gojišče običajno vsebuje aminopterin, ki preprečuje rast nezlitih mielomskih celic.

●Presejanje in kloniranje
Nastale hibridomske celice se pregledajo glede na tvorbo protiteles, specifičnih za ciljni antigen. To se običajno izvede z uporabo tehnik, kot so encimsko vezan imunski test (ELISA), Western blot, imunoprecipitacija in pretočna citometrija.

Ko so hibridomske celice, ki proizvajajo protitelo, identificirane, se klonirajo, da se ustvari populacija identičnih celic. To zagotavlja, da je protitelo, ki ga proizvaja vsaka hibridomska celica, identično.

5. Preverjanje funkcionalnosti protiteles
Alpha Lifetech nudi funkcionalno validacijo protiteles, kot so Western blot, imunohistokemija ali funkcionalni testi, za karakterizacijo monoklonskih protiteles in potrditev specifičnosti, afinitete in funkcionalnosti protiteles.

6. Optimizacija protiteles
Čiščenje protiteles iz supernatanta kulture z uporabo tehnik, kot sta afinitetna kromatografija proteina A ali proteina G, Alpha Lifetech pa lahko zagotovi tudi metode modifikacije protiteles za izboljšanje afinitete protiteles.

7. Proizvodnja protiteles
Alpha Lifetech lahko oceni kandidatna protitelesa za visokozmogljive presejalne aplikacije in obsežno proizvodnjo.

pogosta vprašanjapogosta vprašanja

Pogosta vprašanja o razvoju monoklonskih protiteles

1

Kako izbrati pravi fuzijski hibridom?

Med postopkom fuzije se 10–15 96-jamičnih mikrotitrskih plošč zaseje z mešanico fuzijskih hibridov. Vsaka plošča se napolni s selekcijskim medijem HAT-IMDM in se vzdržuje v inkubatorju z ogljikovim dioksidom pri 37 stopinjah Celzija. 9–14 dni po fuziji se hibridni supernatanti testirajo na prisotnost specifičnega protitelesa, ki nas zanima.
2

Kako izboljšati učinkovitost izbire?

Fuzija plazemskih celic z njihovimi mielomskimi dvojniki ni 100-odstotno učinkovita. Tudi v optimalnih pogojih in najučinkovitejši stimulaciji celična fuzija še vedno ustvari mešanico nekonfluentnih in konfluentnih celic, ki jih je treba ločiti. Za izboljšanje učinkovitosti selekcijskega procesa mielomske celice, uporabljene za fuzijo, nimajo HGPRT, ključnega encima v poti reševanja nukleotidov. Mešanica je bila nato gojena v gojišču HAT, kjer so bile sposobne preživetja le celice z encimom HGPRT, hibridomi, ki so podedovali HGPRT od plazemskih celic.
3

Kako presejati hibridomske celične linije glede aktivnosti protiteles?

Vrednotenje hibridnih sort je ključni korak. Običajno se presejalni testi supernatantov hibridomov, klonov in subklonov izvajajo z encimsko vezanim imunskim testom (ELISA), Western blot testom in sortiranjem celic s fluorescenco (FACS). Odločili se bomo, da bomo vse presejalne teste supernatantov izvajali v lastnem laboratoriju.
4

Navedite podrobna navodila za izvedbo presejanja aktivnosti protiteles?

Hibridomski supernati, ki jih je treba testirati, lahko segajo od 500 do 1440 vzorcev in bodo pripravljeni za testiranje v 9. do 14. dnevu. Lahko nastanemo v obdobju treh do petih dni ali pa smo vsi pripravljeni isti dan, zato je pomembno, da je laboratorij stranke pripravljen tedne vnaprej z delujočimi specifičnimi sekundarnimi presejalnimi testi po izbiri.
5

Zakaj je treba pozitivne hibridome subklonirati?

Potem ko so bile med začetnim postopkom presejanja ELISA identificirane pozitivne vdolbinice, so bili hibridomi preneseni na večji volumen, tj. na 24-vdolbinske plošče, v pripravo na postopek subkloniranja. Subkloniranje hibridomov se običajno izvaja z metodo omejenega redčenja, da se zagotovi izolacija stabilnih monoklonov. Tehnika vključuje redčenje hibridomskih kultur in njihovo dispergiranje na 96-vdolbinske plošče, da se doseže monoklonalnost (ena celica na vdolbinico). Za zmanjšanje tveganja za razvoj mešanih hibridomskih populacij je treba izvesti vsaj dve omejeni redčitvi.
6

Kakšne so prednosti uporabe hibridomske tehnologije za odkrivanje protiteles?

Hibridne celične linije so bile pohvaljene zaradi svoje sposobnosti, da na najbolj stroškovno učinkovit način proizvajajo protitelesa z visoko afiniteto, stabilnostjo in specifičnostjo.