Platforma e Matjes së Afinitetit

Bazuar në platformën Octet dhe Biacore-T2000, Alpha Lifetech mund të ofrojë shërbime të besueshme të përcaktimit të afinitetit. Ne mund të ofrojmë përcaktim të afinitetit për mostra të shumta, siç janë antitrupat, qelizat, proteinat, molekulat e vogla etj. Ekzistojnë metoda të ndryshme të përcaktimit të afinitetit, duke përfshirë përcaktimin e afinitetit me rezonancën sipërfaqësore të plazmoneve (SPR) dhe ndërhyrjen bio-shtresore (BLI).

Alpha Lifetech ka një platformë profesionale dhe të saktë të përcaktimit të afinitetit që kombinon ELISA me përcaktimin e afinitetit, duke ofruar rezultate profesionale, efikase, të shpejta dhe precize të përcaktimit të afinitetit për klientët në mbarë botën. Ne mund t'u ofrojmë klientëve dy metoda për të zgjedhur: Përcaktimi i Shpejtë i Afinitetit dhe Përcaktimi i Preciz i Afinitetit. Përcaktimi i shpejtë i afinitetit është një përcaktim me një përqendrim të vetëm, ndërsa përcaktimi i saktë i afinitetit mund të matë afinitetin e përqendrimeve të ndryshme. Zbatohet në studimin e ndërveprimeve midis përbërjeve të ndryshme të molekulave të vogla, peptideve, proteinave, oligonukleotideve dhe oligomerëve, si dhe lipideve, bakteriofagëve, viruseve dhe qelizave. Platforma e matjes së afinitetit mund të hedhë themelet për testimin dhe shqyrtimin e barnave me afinitet, zbulimin e antitrupave dhe të lehtësojë kërkimet pasuese.

Hyrje në Afinitetin e Lidhjes

Afiniteti është i rëndësishëm në vlerësimin e ndërveprimeve ndërmolekulare, analizat e afinitetit të barnave dhe shqyrtimin e barnave. Ndërveprimet ndërmolekulare mund të përshkruhen nga ekuacionet: L + R = LR, ku L përfaqëson ligandët e lirë, R përfaqëson receptorët e palidhur dhe LR përfaqëson komplekset e ligand-receptor të lidhur. Reaksionet e lidhjes përcaktojnë ndërveprimet ndërmolekulare, ku ndodh shkëmbimi dinamik midis gjendjeve të lidhura dhe të palidhura gjatë reaksionit derisa të arrihet ekuilibri. Kjo mund të përshkruhet nga dy konstantet e shpejtësisë, Kon (konstantja e shpejtësisë së lidhjes) dhe Koff (konstantja e shpejtësisë së disociimit), të reaksionit. Vlera Kd, e cila është reciproke e konstantës së lidhjes (Ka), është Koff/Kon, një konstante e rëndësishme për afinitetin e reaksionit. Prandaj, sa më e fortë të jetë lidhja midis dy molekulave, aq më i lartë është afiniteti. Sa më e vogël të jetë vlera Kd, aq më e kundërta. Ky ekuacion mund të përfaqësohet si një kurbë në formë S në një grafik gjysmë-logaritmik, me përqendrimin e ligandit në boshtin x (në boshtin e shkallës logaritmike) dhe kufirin fraksional në boshtin y. Vija e ndërprerë përfaqëson përqendrimin e ligandit në një Kd (1 nM) prej 0.5 të fraksionit të lidhjes.

Fig. 1: Kurba e lidhjes sigmoidale e përqendrimeve të ndryshme të ligandit të lidhur me receptorin e sipërfaqes qelizore. (Burimi i referencës: Hunter SA, Cochran JR. Analizat e Lidhjes Qelizore për Përcaktimin e Afinitetit të Ndërveprimeve Proteinë-Proteinë: Teknologjitë dhe Konsideratat.)

Metodat për Përcaktimin e Afinitetit

Analiza e afinitetit të lidhjes ELISA

Teknika e përdorur gjerësisht për të studiuar afinitetin e antitrupave bazohet në metodën ELISA, e cila karakterizohet nga komoditeti, shpejtësia, thjeshtësia, ndjeshmëria e lartë dhe specifika e fortë. Ajo mund të përdorë një sasi të vogël reagentësh (domethënë, antitrupa dhe antigjene) dhe të matë afinitetin e antitrupave pa pasur nevojë për reagentë pastrimi. Duke imobilizuar antigjenin në një sipërfaqe të ngurtë dhe duke e zbuluar atë duke përdorur një antitrup primar, antitrupi sekondar i etiketuar reagon me antitrupin primar për të lexuar dhe analizuar të dhënat në një lexues të analizës imunosorbent të lidhur me enzimën (ELISA).

Fig. 2: Analiza të ngjashme me ELISA për të vlerësuar lidhjen e peptideve të projektuara me objektivat e tyre. (Burimi i referencës: Hajikarimlou, Maryam, et al., 2022. Një qasje llogaritëse për të hartuar me shpejtësi peptide që zbulojnë proteinën sipërfaqësore S të SARS-CoV-2.)

Analiza e afinitetit të lidhjes së Rezonancës së Plazmonit Sipërfaqësor (SPR)

Teknologjia SPR zbulon kryesisht ndryshimet në indeksin e thyerjes. Me ndihmën e fenomeneve tradicionale optike dhe fenomenit të rezonancës së dritës, mund të ndërtohet një teknologji analize biosensore për bashkëveprimin midis biomolekulave për të zbuluar bashkëveprimin midis ligandeve dhe analitëve në çipat biosensorë. Sinjalet specifike të lidhjes dhe bashkëveprimit midis biomolekulave mund të merren duke monitoruar ndryshimet dinamike në këndet SPR gjatë reaksioneve biologjike.

Fig. 3: Analiza e rezonancës sipërfaqësore të plazmonit (SPR) e lidhjes H10/AGR2. (Burimi i referencës: Garri, Carolina, et al., 2018. Identifikimi, karakterizimi dhe aplikimi i një peptidi të ri kundër homologut 2 të gradientit anterior (AGR2).)

Analiza e afinitetit të lidhjes së Ndërhyrjes së Shtresës Bio (BLI)

Teknologjia e interferencës së biofilmit është një teknikë detektimi optik pa etiketë, monitorimi në kohë reale, që përdoret kryesisht për analiza sasiore gjithëpërfshirëse të ndërveprimeve ndërmolekulare dhe përcaktimin e përqendrimit të proteinave. Kjo teknologji përdor një biosensor të bazuar në sondë për të zbuluar drejtpërdrejt ndryshimet në trashësinë e biofilmit në mostër. Duke zbuluar ndryshimet e zhvendosjes së spektrit të interferencës, zbulohet lidhja dhe disociimi midis biomolekulave që bashkëveprojnë në sipërfaqen e sensorit dhe shfaqet zhvendosja në kohë reale (nm) e spektrit të interferencës.

Fig. 4: Analiza e interferometrisë biologjike (BLI) midis aLDRG dhe kitinoligosakarideve. (Burimi i referencës: Li, Bing, 2023. Karakteristikat dalluese të transkriptomës krahasuese midis rizomorfeve dhe hifeve të Armillaria sp. 541 që marrin pjesë në simbiozën kërpudhore me theks në domenet LysM.)

Krahasimi i Teknologjisë BLI dhe SPR

Emri i Teknologjisë	BLI (Interferometria e Bio-Shtresës)	SPR (Rezonanca e Plazmoneve Sipërfaqësore)
Parimi	Mat ndryshimet në modelin e interferencës së dritës së reflektuar në sipërfaqen e sensorit, duke zbuluar ndërveprimet molekulare nëpërmjet ndryshimeve në trashësinë optike në bio-shtresën. Ai ofron një kurbë lidhjeje në kohë reale (matje direkte).	Mat ndërveprimet molekulare duke zbuluar ndryshimet e sinjalit në indeksin e thyerjes pranë sipërfaqes së çipit të sensorit (ndodh kur drita bashkëvepron me ndërfaqen e arit dhe qelqit, duke shkaktuar ndryshime në indeksin e thyerjes). Të dhënat pasqyrohen si ndryshime në këndin e rezonancës (matje indirekte).
Prodhuesi	Sartorius	GE
Instrument	Biosensorët ForteBio	Instrumenti i Hapur SPR
Sistemi	Sistemi ForteBio Octet (për analizën e ndërveprimit molekular)	TraceDrawer (zhvilluar nga Ridgeview Instruments, Suedi)
Avantazhet	1. Përputhshmëri e gjerë e mostrës, stabilitet i shkëlqyer, veçanërisht për zbulimin e molekulave të vogla (kërkesat specifike për pastërtinë e mostrës dhe kushtet e tamponit janë më pak të rrepta). Çipat SSA janë me kosto efektive për studimet e lidhjes. 2. Rendiment më i shpejtë dhe kohë eksperimentale më të shkurtra krahasuar me SPR.	1. Histori më e gjatë zhvillimi, duke ofruar ndjeshmëri më të lartë në krahasim me BLI. 2. Saktësi dhe qëndrueshmëri më e madhe për aplikime specifike, të tilla si zbulimi i proteinave të rralla ose të vlefshme me të dhëna më të larta afiniteti dhe specifikimi.
Disavantazhet	1. Saktësia e të dhënave është pak më e ulët krahasuar me SPR. 2. Kërkon mirëmbajtje të kujdesshme të instrumentit. 3. Kostoja e çipit SSA është relativisht e lartë.	1. Kushtet tampon për zbulimin e molekulave shumë të vogla mund të jenë të vështira, duke rritur rrezikun e dështimit të zbulimit. 2. Patatinat janë përgjithësisht më të shtrenjta se ato që përdoren në BLI. 3. Avullimi i mostrës gjatë eksperimenteve të zgjatura mund të jetë një problem.
Lloji i çipit	Çipi SSA	Çipi NTA

Fushëveprimi i matjes së afinitetit

Përcaktimi i afinitetit mund të përfshijë antigjen-antitrup (antigjen-antitrup i fortë, antigjen-antitrup i dobët), proteinë-proteinë, proteinë-peptid, proteinë-molekulë e vogël dhe ADN/ARN proteinë (aptamer). Kur matet KD, është e nevojshme të dihet një nga përqendrimet molare. Kur molekulat e vogla lidhen, një peshë molekulare nuk mund të jetë më pak se 150 daltonë.

Lloji	Fushëveprimi	Masa paraprake
1. Antigjen-Antirup	10^-6 deri në 10^-12	Vlerat Kd të shumicës së antitrupave janë në diapazonin 10^-6-10^-7 deri në 10^-9. Besohet përgjithësisht se antitrupat me afinitet të lartë janë brenda 10^-9, ndërsa antitrupat me afinitet të lartë janë brenda 10^-12.
2. Proteina - Molekula të Vogla	10^-4 deri në 10^-5	KD e molekulave të vogla dhe proteinave është midis 10^-4 dhe 10^-5, ndërsa 10^-3 dhe 10^-7 janë normale dhe nuk mund të arrijnë 10^-10. Molekulat e vogla kovalente mund të arrijnë 10^-10.
3. Avidinë-Biotinë	10^-14	Afiniteti mund t’i nënshtrohet lehtësisht lidhjes jospecifike, dhe mund të përdoret streptavidina ose afiniteti i deglikoziluar.
4. ADN-Proteina	10^-8 deri në 10^-10	ADN me cilësi të lartë dhe të plotë; kini kujdes që të parandaloni ndikimin e elektroforezës.

Kërkesat e mostrës për përcaktimin e afinitetit

Shembull	Kërkesat
1. Mostra e Molekulës së Madhe	Proteinë > 50 µg, antitrup > 100 µg, proteinë e biotiniluar > 200 µg; proteinë pa biotinë > 2 mg, kërkesa për pastërti > 90%, tretësirë tampon: PBS, HEPBS. Nuk mund të përmbajë grupe imidazoli; kërkohet kontroll i cilësisë.
2. Mostër e Molekulës së Vogël	Sasia >1mg, pluhur ose lëng, lëngu duhet të jetë i tretshëm në ujë ose DMSO. Mundohuni të mos përmbani glicerinë, imidazol, trehalozë ose kripëra të tjera; përpiquni të shmangni reagentët me grupe amino si Tris në tampon, përgjithësisht PBS, HEPPS, etj. pa reagentë organikë.

Avantazhet e Platformës së Matjes së Afinitetit

Analiza e mostrave të shumëfishta

Alpha Lifetech mund të ofrojë analiza afiniteti për mostra të ndryshme, duke përfshirë antitrupa, qeliza, proteina dhe biomolekula të tjera.

Platformë teknologjike e pjekur

Ne kemi teknologji të përparuara si analiza e lidhjes spr, analiza e lidhjes bli dhe analiza e lidhjes elisa.

Përzgjedhje fleksibile e projektit

Klientët mund të zgjedhin midis përcaktimit të shpejtë të afinitetit dhe përcaktimit të saktë të afinitetit.

Rezultate me saktësi të lartë

Ekipi ynë teknik profesional mund të sigurojë rezultate efikase, të sakta dhe të besueshme të përcaktimit të afinitetit.

Studimi i rastitRAST

Analiza e shpejtë e afinitetit BLI me antitrupa dhe analiza e afinitetit të aptamerit

Kapni aptamerët e biotiniluar me specifikë të sondës SA dhe tretini ato. Tretni dhe holloni mostrën në një përqendrim të caktuar, ngurtësoni aptamerët e Targetit 1-5 të kapur specifikë për sondën dhe, pas ngopjes së sinjalit, lidheni me mostrën. Pastaj shtojini ato në një pllakë me 96 puseta.

Fig. 5: Shpërndarja e pozicioneve të zbulimit për mostrat e pllakave me 96 puseta. B i referohet tamponit që përdoret për balancimin dhe disociimin e sensorëve. L: Biotina Target 1-5 aptamerë, 221: Mostër.

Kushtojini vëmendje shpimit për të siguruar stabilitetin dhe saktësinë e të dhënave dhe vendosni programin përkatës për të marrë rezultatet:

Fig. 6: Diagrama e përshtatjes së ndërveprimit midis aptamerëve të Targetit 1, 2 dhe 3 dhe mostrave. (CH 1 \ 3 \ 5 përfaqëson sinjalin dhe të dhënat e ndërveprimit midis sondës së aptamerëve të Targetit 1 \ 2 \ 3 të ngurtësuar dhe mostrës.)

Fig. 7: Diagrama e përshtatjes së ndërveprimit midis aptamerëve të Target 4 dhe 5 dhe mostrave. (CH 1 \ 3 përfaqëson sinjalin dhe të dhënat e ndërveprimit midis sondës së aptamerit të Target 4 \ 5 të ngurtësuar dhe mostrës.)

rezultatet tregojnë

U morën rezultatet e mëposhtme: Afiniteti i adaptorit Target 1 me mostrën pas përshtatjes ishte 9.41 ^ -8; afiniteti i adaptorit Target 2 me mostrën pas përshtatjes është 8.32 ^ -8; afiniteti i adaptorit Target 3 me mostrën pas përshtatjes është 8.64 ^ -8; afiniteti i adaptorit Target 4 me mostrën pas përshtatjes është 3.70 ^ -8; afiniteti i adaptorit Target 5 me mostrën pas përshtatjes është 3.01 ^ -8.

Nëse keni ndonjë pyetje, ju lutemi të na kontaktoni në çdo kohë.

Leave Your Message

Shërbim i Sugjeruar

0102