Protokolli i Humanizimit të Antitrupave dhe Pyetjet e Shpeshta

Humanizimi i antitrupave i referohet modifikimit të strukturës së antitrupave të nxjerra nga specie jo-njerëzore (si minjtë, lepujt, etj.) me anë të biologjisë molekulare për t'i bërë ato më afër strukturës së antitrupave të sistemit imunitar të njeriut, duke ruajtur njëkohësisht aktivitetin e tyre origjinal imunitar. Ky proces ka për qëllim kapërcimin e problemit të përgjigjes imune dhe efektit terapeutik të shkaktuar nga "antitrupat heterologë". Me zhvillimin e teknologjisë së antitrupave monoklonalë, humanizimi i antitrupave është bërë një teknologji kyçe në fushën e biofarmaceutikëve.

Antitrupat jo-njerëzorë, siç janë antitrupat e miut, kanë treguar rezultate të mira në trajtimin e sëmundjeve të caktuara, por për shkak se ato rrjedhin nga specie jo-njerëzore, ato janë të lehta për t'u shkaktuar refuzim imunitar kur përdoren te njerëzit. Këto përgjigje imune mund të zvogëlojnë efektin terapeutik dhe madje të çojnë në efekte anësore serioze. Për të zgjidhur këtë problem, shkencëtarët kanë zhvilluar teknologjinë e humanizimit të antitrupave, e cila zëvendëson strukturën e antitrupave jo-njerëzorë me sekuenca më të afërta me antitrupat njerëzorë, në mënyrë që ato të jenë më të pajtueshme me sistemin imunitar të njeriut.

Parimi i Humanizimit të Antitrupave

Antitrupi është një molekulë proteine në formë Y-je e përbërë nga dy zinxhirë të rëndë dhe dy zinxhirë të lehtë. Çdo zinxhir është i përbërë nga një seri aminoacidesh, dhe sekuenca specifike e aminoacideve përcakton karakteristikat e lidhjes së antigjenit të antitrupit. Rajoni variabël (rajoni V) i antitrupit është përgjegjës për lidhjen me antigjenin, ndërsa rajoni konstant (rajoni C) përcakton funksionin biologjik të antitrupit.

Në antitrupat e specieve jo-njerëzore, struktura e vendit të lidhjes së antigjenit është zakonisht mjaft e ndryshme nga ajo e antitrupave njerëzorë. Ky ndryshim mund të bëjë që sistemi imunitar ta konsiderojë atë si një 'substancë ekzotike' për të prodhuar një përgjigje imune. Qëllimi kryesor i humanizimit të antitrupave është të ndryshojë sekuencën e aminoacideve të antitrupit, në mënyrë që rajoni i ndryshueshëm i antitrupit të ruajë aftësinë e lidhjes së antigjenit të antitrupit origjinal sa më shumë që të jetë e mundur, dhe struktura e rajonit konstant të modifikohet për t'iu afruar më shumë strukturës së antitrupit njerëzor.

Ruajtja e vendeve të lidhjes së antigjenit

Në procesin e humanizimit, është e nevojshme të mbahet e pandryshuar struktura e vendit të lidhjes së antigjenit (domethënë, rajoni i ndryshueshëm) i antitrupit për të siguruar specifikën e antitrupit.

Reduktimi i Komponentëve Jo-njerëzorë

Sekuencat e aminoacideve nga speciet jo-njerëzore në zinxhirët e rëndë dhe të lehtë të antitrupave duhet të zëvendësohen gradualisht me sekuenca aminoacidesh njerëzore.

Shmangni Përgjigjen Imune

Duke optimizuar sekuencën e aminoacideve të antitrupit, zvogëloni ose shmangni përgjigjen imune të shkaktuar nga heterologët.

Shpërbërja dhe Stabiliteti Kompleks

Rajoni hidrofobik i proteinës së membranës e bën të lehtë grumbullimin ose precipitimin e saj në tretësira të tretshme në ujë, kështu që nevojiten tampona të përshtatshëm të tretjes dhe stabilizues ndihmës për të ruajtur stabilitetin e strukturës së saj.

Hapat e humanizimit të antitrupave

Zgjidhni burimin e duhur të antitrupave

Zakonisht, hapi i parë në humanizimin e antitrupave është zgjedhja e një antitrupi fillestar efektiv. Antitrupi në përgjithësi rrjedh nga minjtë, lepujt ose specie të tjera, me specifikë të fortë antigjenike dhe afinitet të lartë. Burimi më i përdorur janë antitrupat monoklonalë të miut, të cilët mund të njohin dhe të lidhen me antigjene specifike.

Përcaktoni sekuencën e rajonit të ndryshueshëm të antitrupit

Pas përzgjedhjes së antitrupit të përshtatshëm, studiuesit duhet të përcaktojnë sekuencën e aminoacideve të rajonit të tij variabël. Ky hap zakonisht bëhet me anë të teknologjisë së sekuencimit të gjeneve, bazuar në sekuencën e aminoacideve të antitrupit origjinal, për të përcaktuar se cilat pjesë duhet të zëvendësohen nga një sekuencë më e afërt me antitrupin njerëzor.

Dizajnoni Sekuenca të Humanizuara

Bazuar në bibliotekën e njohur të sekuencave të antitrupave njerëzorë, shkencëtarët hartuan 'sekuenca të humanizuara' të përshtatshme. Metodat e zakonshme përfshijnë:

Metoda e zëvendësimit CDR (Rajoni që përcakton komplementaritetin)

Vetëm rajoni përcaktues i komplementaritetit (CDR) i antitrupit modifikohet për të zëvendësuar sekuencën CDR të specieve jo-njerëzore me sekuencën përkatëse të njerëzve. CDR është një rajon kyç për lidhjen e antitrupave me antigjenet, kështu që ky hap duhet të sigurojë që specifikimi dhe afiniteti i antitrupave të ruhen sa më shumë që të jetë e mundur.

Zëvendësimi i sekuencës së plotë

Në disa raste, e gjithë sekuenca e rajonit të ndryshueshëm duhet të humanizohet për të zëvendësuar të gjitha aminoacidet jo-njerëzore.

Pastrimi i Proteinës së Membranës

Pastrimi i proteinave të membranës zakonisht përdor kromatografinë e afinitetit, kromatografinë e shkëmbimit jonik, kromatografinë e filtrimit në xhel dhe teknika të tjera. Kromatografia e afinitetit zakonisht përdor etiketa (të tilla si etiketat 6xHis) ose pastrim specifik të antitrupave të proteinave të membranës. Filtrimi në xhel përdoret për të ndarë proteinat e membranës dhe papastërtitë e tjera të vogla molekulare sipas madhësisë molekulare. Gjatë procesit të pastrimit, është e rëndësishme të ruhet stabiliteti i proteinave të membranës. Stabilizuesit dhe kushtet e temperaturës së ulët shpesh kërkohen për të parandaluar degradimin ose grumbullimin e proteinave të membranës.

Sinteza dhe Rekombinimi i Gjeneve

Pasi të përfundojë dizajni, përdoret teknologjia e inxhinierisë gjenetike për të sintetizuar gjenin e modifikuar të antitrupave. Gjeni i humanizuar i antitrupave u fut në vektorin e shprehjes me anë të teknologjisë së rekombinimit të gjeneve. Këta vektorë zakonisht janë vektorë viralë ose plazmide që mund të shprehin antitrupat e nevojshëm në qeliza.

Shprehja qelizore dhe prodhimi i antitrupave

Pas rekombinimit të gjeneve, laboratori i transferoi këta vektorë në qeliza pritëse të përshtatshme (si E. coli, qeliza gjitarësh ose qeliza insektesh) për shprehje. Këto qeliza pritëse mund të prodhojnë antitrupa të humanizuar në një shkallë të gjerë në mjedisin e kulturës.

Pastrimi i Antitrupave

Antitrupat e prodhuar duhet të pastrohen, zakonisht duke përdorur kromatografi afiniteti ose teknika të tjera ndarjeje për të nxjerrë molekula antitrupash me pastërti të lartë.

Verifikimi dhe Vlerësimi Funksional

Antitrupi i pastruar duhet të verifikohet funksionalisht për t'u siguruar që ka aftësi të mirë për lidhjen e antigjenit dhe aktivitet biologjik. Metodat e përdorura zakonisht përfshijnë ELISA (analizë imunosorbente e lidhur me enzimën), ngjyrosjen me imunofluoreshencë, citometrinë me rrjedhje, etj.

Eksperimentet në Kafshë dhe Studimet Paraklinike

Pas verifikimit paraprak të antitrupave të humanizuar, zakonisht kryhen eksperimente në kafshë të vogla për të vlerësuar sigurinë dhe efikasitetin e tyre in vivo. Kjo fazë mund të përcaktojë problemet e mundshme siç janë toksiciteti i antitrupave dhe përgjigja imune, si dhe të ofrojë mbështetje të të dhënave për provat klinike.

Provat Klinike dhe Zbatimet

Pas kalimit të studimit paraklinik, antitrupi i humanizuar do të hyjë në fazën e provës klinike. Pas disa raundeve të verifikimit të provës klinike, nëse përmbush kërkesat e sigurisë dhe efektivitetit, mund të hyjë në fazën e aplikimit në treg.

Figura 1. Përmbledhje skematike e strategjisë së humanizimit të Nanobody. (Burimi i referencës: Strategjia e Përgjithshme për Humanizimin e një Antitrupi me Domen të Vetëm të Kamelidit dhe Identifikimi i një Skele Universale të Nano-Trupave të Humanizuar.)

Avantazhet e humanizimit të antitrupave

1Ulja e imunogjenitetit: zvogëlimi i refuzimit nga sistemi imunitar.
2 Përmirësoni sigurinë: zvogëloni efektet anësore dhe reaksionet alergjike.
3 Përmirësoni efikasitetin: Optimizoni lidhjen e antitrupave me antigjenet e synuara dhe rrisni afinitetin.
4 Përmirësimi i gjysmë-jetës: zgjat kohën e veprimit të ilaçit në trup.
5 I përshtatshëm për trajtim afatgjatë: i përshtatshëm për sëmundje kronike dhe trajtim afatgjatë, zvogëlon frekuencën e injeksioneve.
6 Përdoret gjerësisht: i përshtatshëm për kancerin, sëmundjet imune dhe sëmundje të tjera.

Shërbimi gjithëpërfshirës i Alpha Lifetech përfshin projektimin, sintezën, shprehjen dhe karakterizimin e antitrupave të humanizuar, si dhe validimin e funksionit të tyre përmes një sërë analizash in vitro dhe in vivo.

Pyetje të shpeshta

1. Edhe pas trajtimit të humanizuar, disa antitrupa mund të shkaktojnë ende refuzim nga sistemi imunitar, duke rezultuar në prodhimin e antitrupave anti-ilaçe (ADA), duke ndikuar në efikasitetin dhe sigurinë.

Zgjidhja: (1) Modelimi i homologjisë dhe optimizimi i sekuencës u përdorën për të optimizuar rajonet e strukturës së antitrupave (FR) dhe për të zvogëluar rajonet e mundshme të imunogjenitetit. (2) I kombinuar me mjete parashikimi të imunogjenitetit in vitro (siç është parashikimi i epitopeve të qelizave T) për optimizim. (3) Përdorni një bibliotekë antitrupash plotësisht njerëzore (siç është Phage Display) ose inxhinieri të antitrupave monoklonal për të zvogëluar imunogjenitetin.
2. Procesi i humanizimit mund të çojë në një ulje të afinitetit të antitrupave dhe antigjeneve, duke ndikuar në efikasitet.

Zgjidhjet: (1) Teknologjia e mutacionit të kundërt u përdor për të rivendosur vendet kyçe dhe për të përmirësuar afinitetin. (2) E kombinuar me simulimin kompjuterik, struktura e rajoneve përcaktuese plotësuese (CDR) u optimizua për të përmirësuar afinitetin. (3) Antitrupat optimizohen nga teknikat e maturimit të afinitetit (siç është shqyrtimi i shfaqjes së fagut).
3. Humanizimi i antitrupave mund të ndikojë në stabilitetin e palosjes, duke çuar në agregim ose degradim, duke ndikuar në zhvillimin e barnave.

Zgjidhjet: (1) Vendet e qëndrueshme të mutacionit u shqyrtuan me anë të simulimit kompjuterik. (2) Mutacioni i drejtuar përdoret për të optimizuar rajonet kryesore strukturore dhe për të përmirësuar stabilitetin. (3) Shprehja in vitro dhe verifikimi funksional u kryen për të siguruar që antitrupi ruajti aktivitetin dhe stabilitetin e tij origjinal.
4. Kur antitrupat e humanizuar shprehen në qelizat e gjitarëve, mund të ndodhë rendiment i ulët ose palosje e gabuar.

Zgjidhje: (1) Sistemi i duhur i shprehjes (siç janë qelizat CHO) u zgjodh për të optimizuar shprehjen e antitrupave. (2) Rregullimi i peptidit të sinjalit dhe optimizimit të kodonit për të përmirësuar efikasitetin e përkthimit. (3) Inxhinieria e proteinave (siç është optimizimi i vendeve të glikozilimit) u përdor për të përmirësuar stabilitetin dhe nivelet e shprehjes.
5. Antitrupat e humanizuar mund të tregojnë një gjysmë-jetë më të shkurtër, duke ndikuar në efikasitetin e ilaçit.

Zgjidhjet: (1) Ndërveprimi midis antitrupave dhe receptorit Fc të të porsalindurve (FcRn) u optimizua nga inxhinieria Fc për të përmirësuar gjysmë-jetën. (2) Modifikimi ose bashkimi i PEG-së, siç është albumina e serumit njerëzor, u përdor për të përmirësuar stabilitetin in vivo. (3) Modelimi PK/PD u krye për të optimizuar dozën dhe regjimin e dozimit.

referencë

[1] Safdari Y, Farajnia S, Asgharzadeh M, Khalili M. Metodat e humanizimit të antitrupave - një rishikim dhe përditësim. Biotechnol Genet Eng Rev. 2013;29:175-186. doi:10.1080/02648725.2013.801235

[2] Jiacomini IG, Beltramino M, Boursin F, etj. Një strategji efektive për humanizimin e fragmenteve të antitrupave sipas një afati kohor të përshpejtuar. Int J Biol Macromol. 2022;216:465-474. doi:10.1016/j.ijbiomac.2022.06.195

[3] Vincke C, Loris R, Saerens D, Martinez-Rodriguez S, Muyldermans S, Conrath K. Strategji e përgjithshme për të humanizuar një antitrup me një domen të vetëm të devesë dhe identifikimi i një skeleti universal të nano-trupave të humanizuar. J Biol Chem. 2009;284(5):3273-3284. doi:10.1074/jbc.M806889200

[4] Aubrey N, Billiald P. Humanizimi i fragmenteve të antitrupave: Duke filluar me fundin në mendje. Methods Mol Biol. 2019;1904:231-252. doi:10.1007/978-1-4939-8958-4_10

[5] Waldmann H. Antitrupat Monoklonalë Njerëzorë: Përfitimet e Humanizimit. Methods Mol Biol. 2019;1904:1-10. doi:10.1007/978-1-4939-8958-4_1