Shërbimi i Kërkimeve Aptamer

Hyrje në Aptamer

Aptamerët janë molekula të acidit nukleik me një fije të vetme (si ADN ose ARN) që shqyrtohen in vitro nga një bibliotekë oligonukleotidesh sintetike me sekuenca të caktuara rastësisht nga një proces i quajtur shqyrtim SELEX, i cili përfshin raunde të shumëfishta përzgjedhjeje iterative. Komponentët kryesorë të shërbimeve të zhvillimit të aptamerëve në pronësi të Alpha Lifetech përfshijnë ndërtimin e bibliotekës së aptamerëve, shqyrtimin SELEX të aptamerëve, sekuencimin SELEX të aptamerëve, analizën e sekuencës së aptamerëve dhe analiza të tjera të aptamerëve.

Sekuencimi SELEX kombinon shqyrtimin SELEX të aptamerit dhe sekuencimin me rendiment të lartë. Nëpërmjet sekuencimit SELEX të aptamerit, sekuenca specifike e aptamerit të lidhur me objektivin mund të përcaktohet në mënyrë efikase, duke ofruar të dhëna bazë për analizën dhe zbatimin pasues të sekuencës së aptamerit.

Aptamerët janë përdorur gjerësisht në kërkimin shkencor, trajtimin e sëmundjeve, ndërtimin e biosensorëve, zbulimin e ilaçeve dhe monitorimin mjedisor. Megjithatë, aptamerët oligonukleotide të testuar in vitro u degraduan lehtësisht in vivo dhe madje shfaqën toksicitet. Prandaj, pas optimizimit të aptamerëve të testuar, analiza in vitro është e nevojshme për të vlerësuar suksesin e zhvillimit të aptamerëve. Sipas nevojave të ndryshme të analizës së klientëve, Alpha Lifetech ofron një sërë strategjish të analizës së aptamerëve që klientët mund të zgjedhin.

Fig.1 Diagrama e analizës së aptamerit. Burimi i referencës:Thevendran R, Citartan M. 2022. Analiza për të Vlerësuar Afinitetin e Lidhjes së Aptamerëve.

Hyrje në Shërbimin e Kërkimit Aptamer

Analiza e Stabilitetit të Aptamerit

Eksperimenti i degradimit të nukleazës

Duke inkubuar aptamerin me lloje të ndryshme të nukleazave (si DNase, RNase, etj.) në kushte specifike, vërehet degradimi i aptamerit, në mënyrë që të vlerësohet aftësia e tij kundër degradimit. Kjo është e dobishme për të përcaktuar stabilitetin dhe qëndrueshmërinë e aptamerit në zbatimet praktike.

Metoda e etiketimit fluoreshent

Stabiliteti i aptamerit vlerësohet në mënyrë indirekte duke etiketuar fluoroforët në aptamer dhe duke vëzhguar ndryshimet e sinjalit të fluoreshencës para dhe pas lidhjes me objektivin. Për shembull, kur një aptamer lidhet me një objektiv, konformacioni i tij mund të ndryshojë, duke rezultuar në një sinjal të rritur ose të zvogëluar të fluoreshencës.

Analiza e stabilitetit termik

Stabiliteti termik i aptamerit vlerësohet duke matur ndryshimin e temperaturës së shkrirjes së tij (vlera Tm) në temperatura të ndryshme. Sa më e lartë të jetë temperatura e shkrirjes së aptamerit, aq më i mirë është stabiliteti i tij termik.

Analiza e stabilitetit dinamik

Rezonanca sipërfaqësore e plazmoneve (SPR) dhe teknologji të tjera u përdorën për të monitoruar procesin e lidhjes dhe shkëputjes midis aptamerit dhe objektivit në kohë reale, për të marrë parametra dinamikë (siç janë konstanta e shkallës së lidhjes, konstanta e shkallës së disociimit, etj.), për të kuptuar më tej mekanizmin e bashkëveprimit midis aptamerit dhe objektivit dhe për të vlerësuar stabilitetin e tij dinamik.

Analiza e stabilitetit strukturor

Kristalografia me rreze X, rezonanca magnetike bërthamore (NMR) dhe teknika të tjera të biologjisë strukturore u përdorën për të analizuar strukturën tre-dimensionale të aptamerit dhe stabilitetin e tij strukturor.

Analiza Specifike e Aptamerit

Analiza e lidhjes së aptamerit

Afiniteti vlerësohet duke kryer një analizë të lidhjes së aptamerit për të matur konstanten e lidhjes midis aptamerit dhe molekulës së synuar, siç është konstantja e disociimit Kd. Një vlerë më e ulët e Kd tregon një afinitet më të lartë. Analiza e lidhjes së aptamerit mund të dallojë kandidatët për ilaçe me aftësi të lartë lidhëse dhe më pas të kryejë studime të mëvonshme farmakodinamike dhe farmakokinetike.

Eksperimenti i shqyrtimit të kundërt

Analiza e shqyrtimit të kundërt është një metodë shqyrtimi për të përjashtuar shpejt molekulat jo-objektive nga një numër i madh molekulash kandidate. Shqyrtimi i kundërt është projektuar për të përjashtuar molekulat që nuk e posedojnë këtë veti ose funksion. Çelësi i shqyrtimit të kundërt është të zgjidhni shënjuesit ose kushtet e duhura të shqyrtimit të kundërt që mundësojnë identifikimin dhe heqjen e molekulave jo-objektive gjatë procesit të shqyrtimit. Në këtë eksperiment, përzgjedhja e molekulave jo-objektive është shumë e rëndësishme. Duhet të sigurohet që molekulat jo-objektive të përzgjedhura të jenë përfaqësuese të substancave që mund të ndërhyjnë në shqyrtimin e aptamerit dhe që faktorët e mundshëm ndërhyrës të mbulohen sa më plotësisht të jetë e mundur.

Eksperimenti i frenimit konkurrues

Duke shtuar konkurrentë të tepërt (si molekula me strukturë të ngjashme me molekulën e synuar) në sistemin e lidhjes së aptamerit dhe molekulës së synuar, vërehet ndryshimi i aftësisë lidhëse të aptamerit dhe molekulës së synuar. Nëse aftësia e aptamerit për t'u lidhur me molekulën e synuar zvogëlohet ndjeshëm, kjo tregon se aptameri ka specifikë të lartë.

Në disa raste, eksperimentet e frenimit konkurrues mund të përdoren si pjesë ose si një shtesë e eksperimenteve të shqyrtimit të kundërt. Për shembull, në procesin e shqyrtimit të ilaçeve, aftësia e molekulës së ilaçit për t'u lidhur me proteinën e synuar mund të vlerësohet me anë të eksperimenteve të frenimit konkurrues, dhe më pas eksperimentet e shqyrtimit të kundërt mund të përdoren për të hequr ato komponime që janë shumë të lidhura me qelizat ose indet normale.

Analiza e Citotoksicitetit të Aptamerit

Ekzistojnë një sërë metodash eksperimentale për analizën e citotoksicitetit të aptamerëve, të cilat janë të dizajnuara për të vlerësuar efektet e aptamerëve në mbijetesën, përhapjen ose funksionin e qelizave.

Metodat	Hyrje e detajuar	Avantazhi	Disavantazhi
Metoda e Zbulimit MTT	Analiza MTT është një metodë e bazuar në aktivitetin enzimatik në mitokondritë e qelizave të gjalla. Sukcinat dehidrogjenaza në mitokondritë e qelizave të gjalla mund ta zvogëlojë MTT-në ekzogjene në kristalin e patretshëm në ujë, Formazan, dhe ta depozitojë atë në qelizë, ndërsa qelizat e ngordhura nuk kanë një funksion të tillë. Tretja e këtyre kristaleve nga dimetil sulfoksidi (DMSO) dhe zbulimi i absorbimit në gjatësi vale specifike (si 490 nm ose 570 nm) në një enzimoletër mund të pasqyrojë në mënyrë indirekte numrin e qelizave të gjalla dhe kështu të vlerësojë citotoksicitetin e aptamerit.	Ndjeshmëri e lartë, ekonomi dhe komoditet	Ngarkesë e madhe pune, tretësit organikë mund të shkaktojnë dëmtime të qelizave; Vetëm rezultatet përfundimtare eksperimentale mund të merren dhe procesi i plotë i citotoksicitetit nuk mund të shihet.
Metoda e Zbulimit CCK-8	Kit-8 i Numërimit të Qelizave (CCK-8) është një metodë zbulimi kolorimetrik me ndjeshmëri të lartë dhe jo-radioaktive. CCK-8 përmban WST-8, i cili reduktohet nga dehidrogjenaza në mitokondritë e qelizave të gjalla për të prodhuar karburant portokalli metil zan shumë të tretshëm në ujë. Sasia e ngjyrosësit mezan të prodhuar është e lidhur linearisht me numrin e qelizave të gjalla, dhe numri i qelizave të gjalla mund të reflektohet indirekt duke matur vlerën e thithjes së dritës së ngjyrosësit Mezan në gjatësinë e valës 450 nm, në mënyrë që të vlerësohet citotoksiciteti i aptamerit.	Funksionim i thjeshtë, nuk ka nevojë për larje të qelizave, zbulim i shpejtë, gamë e gjerë zbulimi linear, ndjeshmëri e lartë, përsëritshmëri e mirë, citotoksicitet i ulët	Çmim i lartë i reagentit; Ndonjëherë është e vështirë të përcaktohet nëse absorbimi i reduktuar është për shkak të një rënieje në numrin e qelizave të gjalla apo një rënieje në aktivitetin e vetë dehidrogjenazës qelizore.
Metoda e Zbulimit të LDH-së	LDH (laktat dehidrogjenaza) është një enzimë që është e qëndrueshme në citoplazmën e qelizave dhe, kur membrana qelizore dëmtohet, LDH çlirohet jashtë qelizës. LDH mund të katalizojë acidin laktik për të formuar piruvat dhe të reagojë me INT (kripërat e tetrazolit) për të formuar substancë kristalore vjollcë. Duke matur absorbimin e saj në një gjatësi vale specifike (si p.sh. 490 nm), mund të pasqyrohet shkalla e dëmtimit të qelizave dhe më pas mund të vlerësohet citotoksiciteti i aptamerit.	Ai pasqyron drejtpërdrejt shkallën e vdekjes së qelizave, ka më pak dëme në qeliza dhe nuk ka ndotje me izotop radioaktiv.	Nevoja për të nxjerrë shpesh qelizat nga inkubatori, e bën operacionin më të ndërlikuar; Mund të merren vetëm rezultatet përfundimtare eksperimentale dhe nuk mund të shihet i gjithë procesi i citotoksicitetit.
Analiza e Imazheve të Qelizave të Gjalla në Kohë Reale	Duke përdorur analizuesin e imazhit të qelizave të gjalla në kohë reale, instrumenti u vendos në inkubator për të vëzhguar dhe regjistruar të gjithë procesin e ciklit të rritjes së qelizave në kohë reale. Citotoksiciteti i aptamerëve mund të vlerësohet duke analizuar ndryshimet morfologjike dhe kurbat e rritjes së qelizave. Kjo metodë mund të ofrojë rezultate video dhe të kuantifikuara të proceseve citotoksike, duke e mbajtur mjedisin e rritjes së qelizave të qëndrueshëm.	Mund të monitorojë procesin citotoksik në kohë reale, me imazhe jo-destruktive, të zvogëlojë ndërhyrjen dhe dëmtimin e qelizave; Si rezultatet video ashtu edhe ato të kuantifikuara janë të disponueshme për analiza të thella.	Kostot e pajisjeve janë të larta dhe kërkojnë aftësi profesionale operative dhe aftësi për analizën e të dhënave.

KAÇI

Avantazhi i Shërbimit të Kërkimit Aptamer

Kontroll i plotë i cilësisë

Aptamerë të optimizuar me stabilitet më të lartë

Ekonomik dhe efikas. Çmim më konkurrues, shërbim më i mirë.

Vende gjithëpërfshirëse kërkimore dhe metoda të shumta kërkimore

Konsultime profesionale para shitjes dhe shërbime mbështetjeje pas shitjes

Përvojë e pasur në analizën e aptamerit

Ekipi i R&D i nivelit të lartë

Shërbime të personalizuara që lidhen me aptamer-in

Kthehu te faqja e platformës së zhvillimit Aptamer

Nëse keni ndonjë pyetje, ju lutemi të na kontaktoni në çdo kohë.

Leave Your Message

Shërbim i Sugjeruar

0102