Protokolli BLI dhe SPR dhe Pyetjet e Shpeshta

Rezonanca sipërfaqësore e plazmoneve (SPR) dhe Interferometria Bio-Layer (BLI) janë dy teknika të zbulimit të afinitetit që përdoren zakonisht. Të dyja teknikat mund të ofrojnë informacion në kohë reale mbi bashkëveprimin molekular të paetiketuar, të monitorojnë të gjithë procesin e lidhjes molekulare dhe të llogarisin të dhënat kryesore siç janë afiniteti ndërmolekular (KD), shkalla e lidhjes (ka) dhe shkalla e disociimit (kd). Ato janë të përshtatshme për të studiuar bashkëveprimet e komponimeve të ndryshme të molekulave të vogla, peptideve, proteinave, oligonukleotideve, fagëve, viruseve dhe qelizave.

Rezonanca e Plazmoneve Sipërfaqësore (SPR)

Rezonanca sipërfaqësore e plazmoneve (SPR) është një fenomen optik. Kur substanca ose sasia e substancës në sipërfaqen e metalit ndryshon, indeksi i thyerjes ndryshon në përputhje me rrethanat. Këndi i rezonancës së spektrit SPR ndaj indeksit të thyerjes së mjedisit në kontakt me metalin.

Parimi i Rezonancës së Plazmonit Sipërfaqësor

Biosensorët e afinitetit SPR janë pajisje që përbëhen nga tre nënsisteme kryesore: hardueri i sensorit (lexuesi optik), elementi i bionjohjes dhe sistemi i përgatitjes dhe shpërndarjes së mostrës. Në lexuesin optik të sensorit SPR, vala e dritës ngacmon modalitetin special të fushës elektromagnetike të plazmonit sipërfaqësor (SP). Plazma sipërfaqësore përhapet përgjatë filmit të hollë metalik dhe fusha e saj elektrike zbulon mediumin pranë sipërfaqes metalike. Çdo ndryshim në indeksin e thyerjes pranë sipërfaqes metalike do të çojë në një ndryshim në shpejtësinë e përhapjes së plazmës sipërfaqësore. Ky ndryshim në përhapje mund të përcaktohet nga karakteristikat e valës optike të shoqëruara me plazmonin sipërfaqësor. Elementet e bionjohjes specifike për molekulat e analitit janë të imobilizuara në sipërfaqen metalike. Kur mostra e lëngshme është në kontakt me sipërfaqen e sensorit, molekulat e analitit do të kapen nga molekulat e bionjohjes. Ky kombinim çon në një ndryshim në indeksin e thyerjes pranë sipërfaqes së sensorit, i cili mund të matet nga një lexues optik. Mostra e lëngshme futet në sipërfaqen e sensorit përmes një sistemi përgatitjeje dhe shpërndarjeje të mostrës. Në biosensorët e afinitetit SPR, elementi i njohjes biomolekulare është i imobilizuar në sipërfaqen e ngurtë të lexuesit të sensorit SPR dhe kap molekulat e analitit.

Figura 1. Parimi i funksionimit të biosensorëve të afinitetit SPR. (Burimi i referencës: Biosensimi i Rezonancës së Plazmonit Sipërfaqësor.)

Lani

Pas inkubimit, proteinat e palidhura dhe proteinat jo-specifike duhet të hiqen me anë të hapave të larjes. Tamponët e larjes zakonisht përmbajnë një përqendrim të caktuar të kripërave (siç është NaCl) dhe detergjentëve (siç është Triton X-100) për të zvogëluar lidhjen jo-specifike. Hapi i larjes është çelësi i eksperimentit Pull-down, i cili përcakton specifikën dhe raportin sinjal-zhurmë të eksperimentit.

Elucion

Kompleksi i proteinave të lidhura duhet të çlirohet nga mbështetësja e ngurtë me anë të tamponit të elucionit. Metoda e elucionit varet nga karakteristikat e etiketës dhe mbështetëses së ngurtë:

1Elucion konkurrues: për shembull, proteinat e etiketuara me GST eluohen me përqendrime të larta të glutationit.
2 Ndryshimet në pH ose forcën jonike: Për shembull, proteinat e etiketuara me His eluohen me tampona me pH të ulët ose përqendrime të larta të imidazolit.
3 Elucioni me copëtim: Nëse etiketa përmban një vend copëtimi (siç është një vend i proteazës TEV), proteina e synuar mund të çlirohet me anë të copëtimit.

Zbulimi dhe Analiza

1SDS-PAGE: Proteina e eluuar u nda me anë të elektroforezës SDS-PAGE.
2 Western blot: Proteinat e synuara ose proteinat ndërvepruese u zbuluan duke përdorur antitrupa specifikë.
3 Analiza e spektrometrisë së masës: Nëse duhet të identifikohen proteina të panjohura ndërvepruese, proteinat e eluuara mund të analizohen me anë të spektrometrisë së masës.

Hapat e Rezonancës së Plazmoneve Sipërfaqësore (SPR)

Ligandi është një biomolekulë e 'imobilizuar' në sipërfaqen e çipit. Analiti është një molekulë 'që rrjedh nëpër' sipërfaqen e çipit në fazën mobile.

Fiksimi i ligandit

Metoda e imobilizimit të ligandit

Ligandët janë të imobilizuar drejtpërdrejt ose tërthorazi në sipërfaqen e çipit.

Lidhje direkte

Ligandi është i lidhur kovalentisht me sipërfaqen e çipit, metoda e zakonshme e çiftëzimit të aminoacideve.

kap

Molekula kapëse është e lidhur në mënyrë kovalente me sipërfaqen e çipit dhe molekula kapëse është e lidhur me ligandin me anë të afinitetit gjatë çdo cikli. Aktivizoni çipin, holloni ligandin në tamponin e fiksuar dhe injektoni kanalin e mostrës. Çipi qëndroi i inaktivizuar për një farë kohe.

Analiza

Hollojeni analitin me të njëjtin tampon analiti. Analiti u injektua në kanalin e mostrës dhe u disociua pas shoqërimit. Si proceset e shoqërimit ashtu edhe të disociimit kryhen në tamponin e analitit. Cikli i analitit u përsërit sipas përqendrimit të analitit. Pas çdo cikli të analizës së ndërveprimit, sipërfaqja e çipit të sensorit u rigjenerua plotësisht me tampon injeksioni për të hequr analitin, dhe cikli tjetër i përqendrimit të analitit kërkoi hapa të përsëritur të injektimit dhe rigjenerimit.

Interferometria e Biofilmit (BLI)

Interferometria e biofilmit (BLI) është një teknikë për të zbuluar reagimin sipërfaqësor të sensorit duke zbuluar ndryshimin e zhvendosjes së spektrit të interferencës. Kur një rreze drite e dukshme emetohet nga spektrometri, formohen dy spektra reflektimi në dy ndërfaqet e filmit optik në fund të sensorit, dhe formohet një spektër interference. Çdo ndryshim në trashësinë dhe dendësinë e filmit për shkak të lidhjes ose disociimit molekular mund të reflektohet nga vlera e zhvendosjes së spektrit të interferencës, dhe një hartë monitorimi e përgjigjes në kohë reale mund të bëhet përmes kësaj vlere zhvendosjeje.

Fazat e Interferometrisë së Biofilmit (BLI)

Përgatitja e reagjentëve dhe instrumenteve

Për të siguruar që të ruhen vetëm ndërveprimet specifike proteinë-proteinë, kompleksi i kapur i nënshtrohet hapave të larjes. Këto larje heqin çdo lidhje jospecifike, duke siguruar që të mbeten vetëm ndërveprimet midis karremit dhe proteinave të vërteta të presë. Kushtet e larjes, duke përfshirë përbërjen dhe forcën e tamponit, janë optimizuar me kujdes për të hequr ndotësit duke ruajtur ndërveprimet specifike.

1Çipa sensorësh BLI (p.sh. Ni-NTA, Proteina A / G, Streptavidin, etj., të përzgjedhura sipas kërkesave eksperimentale)
2 Ligand: molekula të imobilizuara në sensor
3 Analiti: Një molekulë bashkëvepruese që do të zbulohet
4 Tamponët lidhës (siç janë PBS, HBS-EP, etj.)
5 Tamponi i elucionit (hiqni të pakonjuguarin)
6 Tamponi i rigjenerimit (për rigjenerimin e sensorit)

Para-trajtimi i sensorit

Sensori u lag paraprakisht në një tretësirë tampon të përshtatshme për të zvogëluar lidhjen jospecifike dhe për të përmirësuar stabilitetin e sinjalit.

Fiksimi i ligandit

Zgjidhni sensorin e duhur BLI (p.sh., Ni-NTA për proteinën e etiketuar me His, Proteina A / G për antitrupat). Sensori zhytet në tretësirën e ligandit për ta fiksuar ligandin në sipërfaqen e sensorit. Lajeni për të hequr ligandët e palidhur për të siguruar lidhje të qëndrueshme.

Lidhja e analitit

Sensori zhytet në tretësirën e analitit që do të testohet për të monitoruar lidhjen e tij me ligandin. Regjistrohet ndryshimi i sinjalit të interferencës optike (faza e kombinuar).

Procesi i shkëputjes

Sensori u zhvendos në tamponin lidhës për të shkëputur analitin nga ligandi dhe për të monitoruar shkallën e disociimit.

Rigjenerimi i sensorit (Opsional)

Tamponi i rigjeneruar u përdor për të hequr konjugatet ligand-analit, duke e bërë sensorin të ripërdorshëm.

Analiza e të dhënave

Shkalla e lidhjes (ka), shkalla e disociimit (kd) dhe afiniteti (KD) u llogaritën nga kurba e sinjalit të sensorit (faza e lidhjes, faza e disociimit).

Figura 2. Një skemë e hapave të ekuilibrimit, shoqërimit dhe rigjenerimit në secilin cikël analize. (Burimi i referencës: Zbulimi i deoksinivalenolit duke përdorur interferometrinë e bioshtresës.)

Alpha Lifetech ofron analizën e afinitetit SPR dhe analizën e afinitetit BLI. Klientët mund të zgjedhin analizën e duhur të afinitetit sipas nevojave të tyre. Në të njëjtën kohë, Alpha Lifetech ofron edhe shërbime të tjera të matjes së afinitetit, të tilla si shërbimet konkurruese të zbulimit të afinitetit ELISA, për të ndihmuar klientët të kërkojnë më mirë.

Pyetje të shpeshta

1. Llojet e zakonshme të çipave SPR dhe si t'i zgjidhni ato?

(1) Çip i modifikuar karboksil (COOH): përdoret për të imobilizuar molekulat me modifikim amino (-NH2), i cili përdoret gjerësisht në studimin e molekulave biologjike si proteinat dhe antitrupat. (2) Çip i modifikuar amino (NH2): për imobilizimin kovalent të molekulave biologjike me karboksil (-COOH) ose funksione të tjera hidrofile, i përshtatshëm për lidhje specifike molekulare. (3) Çipe të modifikuara hidrofile (si modifikimi PEG): të përshtatshme për eksperimente me zhurmë të ulët në sfond, duke zvogëluar adsorbimin jo-specifik, të përdorura zakonisht në biomolekulat dhe kërkimin e sipërfaqes qelizore. (4) Çip biotinë-streptavidinë: për zbulimin e shënjuesve biomolekularë, i përshtatshëm për lidhje me molekula të biotiniluara.
2. Lidhja jo-specifike e papastërtive në mostër me sipërfaqen e sensorit ndikon në sinjal.

Shkaku: mostra nuk është e pastër, përbërja e tamponit nuk është e përshtatshme. Tretësira: (1) Përdorni modifikime kimike të përshtatshme sipërfaqësore (p.sh. bllokimi i lidhjes jo-specifike të antitrupave ose trajtimi me tretësirë). (2) Për të zvogëluar lidhjen jo-specifike, përdoren tampona që përmbajnë surfaktantë ose përqendrime të larta kripe. (3) Pastroni mostrën dhe hiqni substancat ndërhyrëse.
3. Nuk mund të marrë sinjal mjaftueshëm të fortë, gjë që ndikon në analizën e të dhënave.

Shkaku: sasia e ligandit të fiksuar në sipërfaqen e sensorit është e pamjaftueshme, ose përqendrimi i analitit është shumë i ulët. Zgjidhjet: (1) Rritni sasinë e ligandit të fiksuar në sipërfaqen e sensorit. Rritni përqendrimin e analitit ose optimizoni kohën e injektimit të tij. (2) Përdorni sonda më të ndjeshme ose çipa të përshtatshëm sensori.
4. Llojet e zakonshme të çipave BLI dhe si t'i zgjidhni ato?

(1) Çip i modifikuar me karboksil: Është i përshtatshëm për imobilizimin kovalent të molekulave të modifikuara amino (NH2), siç janë proteinat, antitrupat, etj. (2) Çip i modifikuar me amino: zakonisht përdoret për imobilizimin kovalent të molekulave që përmbajnë grupe karboksil (COOH), i përshtatshëm për imobilizimin e proteinave. (3) Çip avidin/biotinë: për lidhje specifike biomolekulare, siç është bashkëveprimi midis molekulave të biotiniluara dhe avidinës. (4) Çip i modifikuar me aminosilan: Është i përshtatshëm për fiksimin e makromolekulave biologjike (si ADN-ja, proteina) në sipërfaqen e çipit me anë të reaksionit kimik. (5) Çip i modifikuar me PEG: përdoret zakonisht për të parandaluar adsorbimin jo-specifik, për të rritur raportin eksperimental sinjal-zhurmë.
5. Efikasiteti i fiksimit të ligandit në sipërfaqen e sensorit është i ulët, duke rezultuar në sinjale të paqëndrueshme.

Shkaqet: trajtim sipërfaqësor jo i duhur i sensorit ose përqendrim i papërshtatshëm i ligandit. Zgjidhjet: (1) Optimizimi i metodave të imobilizimit të ligandit, siç është zgjedhja e agjentit të duhur të lidhjes kryqëzuese ose metodës së modifikimit. (2) Një përqendrim më i lartë i ligandit u përdor për imobilizim dhe koha e imobilizimit u optimizua.
6. Nuk mund të merren të dhëna të sakta si shkalla e lidhjes (ka) dhe shkalla e disociimit (kd).

Shkaqet: cilësi e dobët e të dhënave, përqendrim i ulët i mostrës ose gabime në procesin e analizës. Zgjidhjet: (1) Zgjidhni diapazonin e duhur të përqendrimit eksperimental për të siguruar cilësinë e të dhënave. (2) Dizajni eksperimental u optimizua për të siguruar pika të mjaftueshme analitike për të llogaritur me saktësi parametrat kinetikë. (3) Sigurohuni që sipërfaqja e sensorit të jetë plotësisht e aktivizuar dhe të ketë lidhje të mjaftueshme të analitit.

referencë

[1] Olaru A, Bala C, Jaffrezic-Renault N, Aboul-Enein HY. Biosensorët e rezonancës sipërfaqësore të plazmonit (SPR) në analizën farmaceutike. Crit Rev Anal Chem. 2015;45(2):97-105. doi:10.1080/10408347.2014.881250

[2] Sun B, Xu J, Liu S, Li QX. Karakterizimi i Ndërveprimeve Molekulë të Vogël-Proteinë Duke Përdorur Metodën SPR. Methods Mol Biol. 2023;2690:149-159. doi:10.1007/978-1-0716-3327-4_15

[3] Piliarik M, Vaisocherová H, Homola J. Biosensing i rezonancës së plazmonit sipërfaqësor. Metodat Mol Biol. 2009; 503:65-88. doi: 10.1007/978-1-60327-567-5_5

[4]Arora P, Sindhu A, Dilbaghi N, Chaudhury A. Biosensors si mjete inovative për zbulimin e patogjenëve që vijnë nga ushqimi. Biosens Bioelektron. 2011; 28 (1): 1-1 doi: 10.1016/j.bios.2011.06.002

[5] Sultana, A. dhe JE Lee, Matja e ndërveprimeve proteinë-proteinë dhe proteinë-acid nukleik me anë të interferometrisë së bioshtresave. Protokollet aktuale në shkencën e proteinave, 2015. 79: f. 19 25 1-26.

[6] Petersen, RL, Strategjitë që Përdorin Teknologjinë e Biosensorëve të Interferometrisë Bio-Shtresë për Kërkimin dhe Zhvillimin e Vaksinave. Biosensorë (Bazel), 2017. 7(4).

[7] Maragos CM. Zbulimi i deoksinivalenolit duke përdorur interferometrinë e bioshtresës. Mycotoxin Res. 2011;27(3):157-165. doi:10.1007/s12550-011-0090-y

[8] Auer S, Koho T, Uusi-Kerttula H, et al. Zbulimi i shpejtë dhe i ndjeshëm i antitrupave të norovirusit në serumin njerëzor me një biosensor interferometrie bioshtrese [J]. Sensorë dhe Aktuatorë B: Kimikë. 2015, 221:507-514.

[9] Maragos C M. Zbulimi i deoksinivalenolit duke përdorur interferometrinë e bioshtresës [J]. MycotoxRes. 2011, 27(3):157-165.