Protokolli i Prodhimit të Antitrupave Kimerikë dhe Pyetjet e Shpeshta

Antitrupi kimerik është një klasë e antitrupave monoklonalë që kombinojnë fragmente antitrupash të specieve të ndryshme (zakonisht antitrupa njerëzorë dhe miu) së bashku përmes teknikave të inxhinierisë gjenetike për të formuar antitrupa monoklonalë me fragmente të ndryshme burimore. Antitrupat kimerik përbëhen kryesisht nga vende të lidhjes së antigjenit të derivuara nga miu (domethënë, pjesë të njohjes së antigjenit, zakonisht VH dhe VL) dhe rajone konstante të derivuara nga njeriu (domethënë, pjesa Fc e antitrupit). Përmes këtij dizajni, antitrupi kimerik jo vetëm që ruan afinitetin e lartë të antitrupit të miut, por gjithashtu mund të bashkëveprojë në mënyrë efektive me sistemin imunitar të njeriut dhe të zvogëlojë përgjigjen imunitare.

Parimi i Prodhimit të Antitrupave Kimerikë

Parimi thelbësor është kombinimi i gjeneve të rajonit variabël (rajoni V) (duke përfshirë VL të zinxhirit të lehtë dhe VH të zinxhirit të rëndë) të antitrupave monoklonalë të miut me gjenet e rajonit konstant (rajoni C) (CL dhe CH) të antitrupave njerëzorë përmes rekombinimit të inxhinierisë gjenetike. Rajoni V përmban rajonin përcaktues plotësues (CDR), i cili ndërmjetëson drejtpërdrejt specifikën e lartë të njohjes së antigjenit. Rajoni C i njeriut përcakton funksionin efektor imunitar të antitrupit (siç është aktivizimi i komplementit, ADCC), dhe për shkak se rrjedh nga njerëzit, ai zvogëlon ndjeshëm refuzimin e sistemit imunitar të njeriut në rajonin konstant të antitrupave heterologë (reaksioni HAMA).

Në zbatimin e teknologjisë, gjeni i rajonit V u amplifikua nga qelizat hibridome të miut, u klonua me PCR dhe u ligua në vektorin e shprehjes që mbante rajonin C të njeriut. Gjeni rekombinant u fut në qelizat pritëse (si CHO ose HEK293), dhe palosja e antitrupave dhe modifikimi i glikozilimit u përfunduan duke përdorur sistemin eukariotik. Antitrupi kimerik i shprehur përfundimtar jo vetëm që ruan afinitetin e lartë ndaj antigjenit të synuar, por gjithashtu ka imunogjenitetin afatgjatë dhe të ulët të antitrupit njerëzor.

Avantazhet e Antitrupave Kimerikë

Antitrupat kimerikë optimizojnë ndjeshëm efikasitetin klinik dhe praktikueshmërinë e prodhimit të antitrupave terapeutikë duke kombinuar specifikën e lartë të antitrupave të miut dhe përputhshmërinë imunitare të antitrupave njerëzorë. Përparësitë e tyre kryesore pasqyrohen në aspektet e mëposhtme:

Zhvillim dhe optimizim efikas

(1) Cikli i shpejtë i zhvillimit: Bazuar në rajonin e ndryshueshëm të verifikuar (rajoni V) të antitrupit monoklonal të miut (mAb), rajoni konstant i njeriut (rajoni C) u klonua dhe u rikombinua drejtpërdrejt, pa pasur nevojë të shqyrtohen gjenet e antitrupave njerëzorë nga e para, gjë që e shkurtoi shumë kohën e zhvillimit.

(2) Ruajtja e afinitetit të lartë: Duke përdorur drejtpërdrejt aftësinë e lartë specifike të lidhjes së antigjenit të rajonit V të miut (veçanërisht rajonit CDR), humbja e afinitetit të antitrupave të humanizuar të shkaktuar nga transplantimi i CDR mund të shmanget.

Zvogëlon imunogjenitetin

(1) Zvogëlimi i përgjigjes HAMA: Përqindja e rajonit konstant njerëzor është më shumë se 70%, gjë që zvogëlon ndjeshëm refuzimin e antitrupave heterologë (përgjigje njerëzore kundër antitrupave anti-mi, HAMA) dhe zgjat gjysmë-jetën e antitrupave. Për shembull, toleranca e rituximabit është dukshëm më e mirë se gjenerata e parë e antitrupave monoklonalë miunë.

(2) Shmangia e Sfidës së Humanizimit të Plotë: Krahasuar me shqyrtimin që kërkon kohë dhe humbjen e mundshme funksionale të antitrupave plotësisht të humanizuar, antitrupat kimerikë mund të balancojnë imunogjenitetin dhe funksionalitetin përmes rekombinimit të thjeshtë të VC.

Përmirësoni funksionin e efektorit imunitar

(1) Përzgjedhje fleksibile e zonës së burimit konstant: Sipas nevojave të trajtimit, mund të zgjidhen nëntipe të ndryshme IgG të rajonit C (si p.sh. IgG1 rrit efektin ADCC / CDC, IgG4 zvogëlon përgjigjen inflamatore).

(2) Mbajtje funksionale e verifikuar klinikisht: Për shembull, infliximab (një antitrup kimerik anti-TNF-α) aktivizon komplementet dhe qelizat imune përmes segmentit IgG1 Fc të njeriut, duke rritur frenimin e përgjigjeve inflamatore.

Fizibilitet i lartë prodhimi

(1) Sistemi i shprehjes së pjekur: Qelizat e gjitarëve (si CHO, HEK293) mund të shprehin në mënyrë efikase IgG të plotë për të siguruar korrektësinë e palosjes së antitrupave dhe modifikimin e glikozilimit.

(2) Efektiviteti i kostos: Krahasuar me procesin kompleks të shqyrtimit të antitrupave plotësisht të humanizuar, procesi i prodhimit të antitrupave kimerikë është më i standardizuar dhe i qëndrueshëm, dhe është më i lehtë të arrihet përgatitja në shkallë të gjerë.

Shkallë e lartë suksesi në transformimin klinik

Ekzistojnë shumë ilaçe të suksesshme: Më shumë se 30% e antitrupave terapeutikë të miratuar në botë janë antitrupa kimerikë, duke përfshirë rituximab (limfomë), cetuximab (kancer kolorektal) dhe bevacizumab (anti-VEGF), të cilët kanë verifikuar sigurinë dhe efikasitetin e tyre.

Hapat e Prodhimit të Antitrupave Kimerikë

Shqyrtimi i antitrupave

Së pari, studiuesit do të injektojnë antigjenin e synuar dhe do të marrin përgjigjen e tij imune duke imunizuar minjtë ose kafshët e tjera. Limfocitet B u izoluan nga kafshët e imunizuara dhe antitrupat me afinitet të lartë ndaj antigjeneve të synuara u shqyrtuan me anë të teknologjisë së antitrupave monoklonalë.

Klonimi i gjenit të antitrupave

ARNi në qelizat B të miut u transkriptua në ADNc me anë të transkriptazës së kundërt. Gjenet e rajonit të ndryshueshëm (VH dhe VL) të antitrupit të miut u amplifikuan me PCR dhe më pas u klonuan në strukturën e antitrupit njerëzor. Gjenet e zinxhirit të rëndë (VH) dhe zinxhirit të lehtë (VL) të antitrupit kimerik u futën me saktësi për të siguruar që ato të mund të shpreheshin saktë.

Shprehja e Antitrupave Rekombinantë

Gjeni i ndërtuar i antitrupit u transfektua në qeliza pritëse të përshtatshme (siç janë qelizat CHO). Nxit rritjen e qelizave pritëse përmes kushteve të përshtatshme të kulturës dhe u mundëson atyre të prodhojnë antitrupa rekombinantë në sasi të mëdha. Qelizat pritëse të përdorura zakonisht janë qelizat CHO (qelizat e vezoreve të hamsterit kinez) dhe qelizat HEK293 (qelizat e veshkave embrionale të njeriut), të cilat kanë aftësi efikase të shprehjes së proteinave.

Pastrimi i Antitrupave

Antitrupat kimerikë të sekretuar nga qelizat pritëse u pastruan duke përdorur kromatografinë e afinitetit (siç është kromatografia e afinitetit të Proteinës A). Antitrupi i pastruar do të zbulohet më tej nga SDS-PAGE dhe Western Blot për të siguruar pastërtinë dhe cilësinë e antitrupit.

Verifikimi dhe Optimizimi Funksional

Aftësia e lidhjes së antitrupit kimerik me antigjenin e synuar u testua me anë të ELISA dhe citometrisë me rrjedhë. Eksperimenti i aktivitetit biologjik u përdor për të verifikuar nëse antitrupi kimerik mund ta aktivizojë në mënyrë efektive sistemin imunitar dhe të bashkëveprojë me qeliza të tjera imune.

Studime paraklinike dhe prova klinike

Eksperimentet në kafshë, si ato në minj, u kryen në laborator për të vlerësuar imunogjenitetin, sigurinë dhe efikasitetin e antitrupave kimerikë. Nëse eksperimenti është i suksesshëm, mund të kryhen prova të mëtejshme klinike dhe përfundimisht të shndërrohen në ilaçe me antitrupa për aplikim klinik.

Figura 1. Diagrama skematike (jo të vizatuara në shkallë) të vektorit të gjenit të zinxhirit të rëndë kimerik mi-njeri (A) dhe vektorëve të gjenit të zinxhirit të lehtë kimerik (B). (Burimi i referencës: Molekulat kimerike të antitrupave njerëzorë: domene që lidhin antigjenin e miut me domene të rajonit konstant të njeriut.)

Alpha Lifetech ofron analiza të Prodhimit të Antitrupave Kimerikë që janë projektuar posaçërisht për të përshpejtuar zhvillimin dhe optimizimin e antitrupave kimerikë për aplikime terapeutike. Këto analiza u mundësojnë studiuesve të vlerësojnë efikasitetin, funksionalitetin dhe specifikën e lidhjes së antitrupave kimerikë në një mënyrë me rendiment të lartë dhe të riprodhueshme.

Pyetje të shpeshta

1. Edhe pse humanizimi i rajonit konstant të antitrupit kimerik zvogëlon përgjigjen HAMA, ka ende pacientë që prodhojnë antitrupa anti-idiotipikë (antitrupa anti-ilaçe, ADA) për shkak të domenit të kornizës së rajonit V (FR) të mbetur nga miu, duke rezultuar në ulje të efikasitetit klinik ose reaksione alergjike.

Zgjidhja: (1) Modifikimi i humanizuar FR: Rajoni kornizë i rajonit V të nxjerrë nga miu u zëvendësua me një sekuencë homologe njerëzore, dhe u ruajt vetëm rajoni CDR (antitrupi i humanizuar Antitrup Hibrid). (2) Heqja e epitopeve të qelizave T: Epitopet që mund të shkaktojnë njohjen e qelizave T në rajonin V u hoqën me anë të parashikimit kompjuterik ose shqyrtimit eksperimental. (3) Agjentët e kombinuar imunosupresivë si metotreksati (MTX) mund të zvogëlojnë prodhimin e ADA-së.
2. Shprehja e pabalancuar, palosja e gabuar ose glikozilimi jonormal i zinxhirëve të rëndë dhe të lehtë të antitrupave kimerikë në qelizat pritëse (siç janë CHO) çon në prodhim të ulët të antitrupave ose funksion të dëmtuar.

Zgjidhje: (1) Vektorë të optimizuar të shprehjes: Shprehja e balancuar e zinxhirit të rëndë (HC) dhe zinxhirit të lehtë (LC) bashkë-rregullohet nga vektorë bicistronikë ose promotorë endogjenë (p.sh., vetë-ndarje duke përdorur elementë IRES ose zinxhirë peptidikë 2A). (2) Rregullimi i kushteve të kulturës: pH, temperatura dhe aditivët e mediumit (siç janë agjentët anti-apoptotikë ose rregullatorët metabolikë) u rregulluan për të rritur dendësinë e qelizave të gjalla. (3) Glikozilimi i optimizuar: nxjerrja jashtë e gjenit të α-1,3-galaktoziltransferazës së strehuesit (siç është linja qelizore CHO-Lec1), ose shtimi i enzimave të inxhinierisë së glikozilimit për të penguar glikoformat anormale.
3. Për shkak të zhvendosjes gjenetike të qelizave pritëse ose luhatjes së kushteve të kulturës, shkaktohet heterogjeniteti i ngarkesës së antitrupave (siç është deamidimi), ndryshimi në proporcionin e llojeve të sheqerit ose rritja e polimerëve.

Zgjidhje: (1) Shqyrtimi i linjave qelizore të qëndrueshme: Klonet e qelizave pritëse me stabilitet të lartë u shqyrtuan me anë të teknikave të klonimit të qelizave të vetme (siç është ClonePix). (2) Kontroll i cilësisë me kurs të plotë: Zhvillimi i metodave të sakta analitike (siç janë CE-SDS, hartëzimi i peptideve, spektrometria e masës) për të monitoruar atributet kritike të cilësisë (CQA). (3) Standardizimi i procesit: Vendosja e proceseve të fuqishme të prodhimit në rrjedhën e sipërme (kultura e perfuzionit) dhe në rrjedhën e poshtme (pastrimi i elucionit me gradient).
4. Rajoni konstant me origjinë njerëzore (siç është IgG4) mund të çojë në dobësimin e efektit ADCC / CDC (siç është nevoja për funksion të fortë vrasës të antitrupave antikancerogjenë).

Zgjidhja: (1) Përzgjedhja e nëntipeve IgG: Sipas kërkesave të trajtimit, ndërroni nëntipet e rajonit konstant (si p.sh. IgG1 rrit lidhjen e FcγR, IgG3 zgjat gjysmë-jetën). (2) Inxhinieria e fragmentit Fc: mutagjeneza e drejtuar nga vendi e fragmentit Fc (si p.sh. mutacioni F158V i FcγRIIIa) për të përmirësuar funksionin efektor.

referencë

[1] Shin SU. Antitrupi kimerik: zbatime të mundshme për administrimin e barnave dhe imunoterapinë. Bioterapia. 1991;3(1):43-53. doi:10.1007/BF02175098

[2] Hyytiä H, Heikkilä T, Brockmann EC, etj. Fragmente të antitrupave rikombinantë kimerikë në imunoanalizën e troponinës I kardiake. Clin Biochem. 2015;48(4-5):347-352. doi:10.1016/j.clinbiochem.2014.06.080

[3] Doki T, Takano T, Hohdatsu T. Zhvillimi i një antitrupi kimerik mi-mace kundër faktorit të nekrozës tumorale të maces-alfa. J Vet Med Sci. 2016;78(9):1447-1455. doi:10.1292/jvms.16-0020

[4] Morrison SL, Johnson MJ, Herzenberg LA, Oi VT. Molekulat kimerike të antitrupave njerëzorë: domene që lidhin antigjenin e miut me domene të rajonit konstant të njeriut. Proc Natl Acad Sci US A. 1984;81(21):6851-6855. doi:10.1073/pnas.81.21.6851

[5] Mueller BM, Romerdahl CA, Gillies SD, Reisfeld RA. Përmirësimi i citotoksicitetit të varur nga antitrupat me një antitrup kimerik anti-GD2. J Immunol. 1990;144(4):1382-1386.