Protokolli i Bashkë-Imunoprecipitimit (Co-IP) dhe Pyetjet e Shpeshta

Bashkë-Imunoprecipitimi (Co-IP) është një teknikë eksperimentale e përdorur zakonisht për të studiuar ndërveprimet proteinë-proteinë (PPI). Nëpërmjet Co-IP, studiuesit mund të kapin një ose më shumë çifte proteinash ndërvepruese në mostra komplekse biologjike për të zbuluar funksionet dhe mekanizmat e tyre rregullatorë në qeliza.

Parimi i bashkë-imunoprecipitimit (Co-IP)

Co-IP bazohet në lidhjen specifike të antitrupit me proteinën e tij të synuar. Në mënyrë tipike, studiuesit përdorin një antitrup specifik për të kapur një proteinë të synuar (zakonisht një 'proteinë karrem'). Në këtë proces, proteina e synuar dhe proteina e saj bashkëvepruese (domethënë, 'proteina chaperone') kapen gjithashtu së bashku. Kompleksi i proteinave u nxor më pas nga lizat qelizor me anë të imunoprecipitimit (IP). Molekulat jo-specifike të lidhjes u hoqën me anë të larjes dhe së fundmi bashkëveprimi i pritur proteinë-proteinë u konfirmua me anë të Western blot dhe metodave të tjera të zbulimit.

Hapat e bashkë-imunoprecipitimit (Co-IP)

Liza e qelizave

Së pari, proteinat duhet të nxirren nga qelizat ose mostrat e indeve, zakonisht përmes lizës së qelizave për të çliruar proteinat intraqelizore.

Hapat e operacionit

Qelizat lizohen duke përdorur tampona të përshtatshme të lizës (zakonisht që përmbajnë frenues të proteazës), dhe tamponi i lizës duhet të mbahet i ftohtë për të parandaluar degradimin e proteinave. Tretësira e lizës zakonisht përmban detergjentë (si Triton X-100) dhe kripëra (si NaCl) për nxjerrje efektive të proteinave. Pasi liza përfundoi, mbeturinat qelizore u hoqën me anë të centrifugimit për të marrë supernatantin (lizatin qelizor).

Përzgjedhja dhe Para-trajtimi i Antitrupave

Antitrupat që lidhen posaçërisht me proteinën e synuar zakonisht janë 'antitrupa karrem' kundër proteinës së synuar. Përveç kësaj, duhet të përgatitet një medium mbështetës i përshtatshëm (siç janë sferat e agarozës së proteinës A/G ose sferat magnetike) për të kapur kompleksin antitrup-proteinë e synuar.

Hapat e operacionit

Zgjidhni antitrupin e duhur sipas nevojave eksperimentale për t'u siguruar që ai mund të lidhet posaçërisht me proteinën e synuar. Nëse antitrupi nuk lidhet drejtpërdrejt me mjedisin mbështetës, është e nevojshme të përdoren paraprakisht sfera të Proteinës A/G ose sfera magnetike për t'u lidhur paraprakisht me antitrupin për të formuar një kompleks antitrup-sferë.

Imunoprecipitim

Antitrupi i proteinës së synuar shtohet në lizat dhe reagon me proteinën në mostër. Antitrupi lidhet posaçërisht me proteinën e synuar, dhe më pas proteina chaperone që bashkëvepron me të kapet gjithashtu së bashku.

Hapat e operacionit

Lizat u inkubua me antitrupin, zakonisht gjatë natës në 4°C për t'u siguruar që antitrupi mund të lidhej plotësisht me proteinën e synuar. Shtoni sfera agaroze të Proteinës A/G të përgatitura paraprakisht ose sfera magnetike dhe vazhdoni inkubimin për një periudhë kohore në mënyrë që kompleksi antitrup-proteinë e synuar të mund të kapet nga sferat.

Larje për të hequr konjugatet jo-specifike

Për të hequr proteinat e lidhura jo në mënyrë specifike, precipitati duhet të lahet disa herë me një tretësirë tampon larës.

Hapat e operacionit

Proteinat jo-specifike të lidhjes në sfera hiqen me anë të centrifugimit ose ndarjes magnetike. Për të zvogëluar zhurmën në sfond përdoren tampona larës që përmbajnë përqendrime të ndryshme të kripës ose detergjentit. Larja disa herë është për t'u siguruar që proteinat e palidhura të lahen, por gjithashtu kini kujdes që të mos lani proteinën e synuar ose proteinën e saj shoqëruese.

Analiza e proteinave

Analizat e lidhjes in vitro, të tilla si ELISA ose rezonanca sipërfaqësore e plazmoneve (SPR), u kryen për të zbuluar aktivitetin e lidhjes së antitrupave bispecifikë. Vlerësoni funksionet e tij biologjike, të tilla si analiza e citotoksicitetit, dhe zbuloni aftësinë e tij për të udhëhequr qelizat efektore për të penguar qelizat shënjestër.

Hapat e operacionit

Sedimenti i larë u nda me anë të elektroforezës SDS-PAGE. Prania e proteinës së synuar dhe proteinës së saj chaperone u zbulua me anë të Western blot dhe metodave të tjera. Antitrupat specifikë kundër chaperoneve mund të përdoren për të konfirmuar nëse ato lidhen me proteinën e synuar. Nëse kryhet analiza e spektrometrisë së masës, proteina e precipituar mund t'i nënshtrohet drejtpërdrejt analizës së spektrometrisë së masës për të identifikuar llojin e proteinës chaperone.

Analiza e Rezultateve

Sipas rezultateve të Western blot ose spektrometrisë masive, u analizua nëse proteina e synuar dhe proteina e saj shoqëruese bashkëvepruese u kapën me sukses.

Hapat e operacionit

Në Western blot, brezat e proteinës së synuar dhe proteinave të tjera u analizuan për të konfirmuar praninë e proteinës chaperone. Nëse përdoret spektrometria masive, llojet dhe ndërveprimet e proteinave chaperone analizohen bazuar në të dhënat e spektrometrisë masive.

1Liza e qelizave: Nxjerrja e proteinave dhe largimi i mbeturinave qelizore.
2 Lidhja dhe paratrajtimi i antitrupave: Zgjidhni dhe përgatitni antitrupa kundër proteinës së synuar.
3 Imunoprecipitimi: Antitrupi lidhet me proteinën e synuar dhe kap proteinën e synuar dhe proteinën e saj shoqëruese.
4 Larja: Hiqni konjugatet jospecifike për t'u siguruar që proteina e kapur është specifike.
5 Analiza e proteinave: Precipitati u analizua me anë të Western blot ose spektrometrisë së masës për të konfirmuar praninë e proteinës së synuar dhe proteinës chaperone.
6 Analiza e rezultateve: Analizoni rezultatet eksperimentale dhe përcaktoni bashkëveprimin midis proteinave.

Figura. 1 Hapat e përfshirë në karakterizimin e një ndërveprimi të proteinave karrem. (Burimi i referencës: Karakterizimi i një interaktome proteinike me anë të bashkë-imunoprecipitimit dhe spektrometrisë së masës me shkop.)

Avantazhet e bashkë-imunoprecipitimit (Co-IP)

Specifikitet i Lartë

Duke përdorur antitrupa kundër proteinave specifike të synuara, mund të kapen ndërveprimet shumë specifike proteinë-proteinë.

Përdoret për mostra komplekse

Co-IP është i përshtatshëm për mostra komplekse biologjike, siç janë lizatet qelizore ose ekstraktet e indeve.

Fleksibilitet

Mund të përdoret në kombinim me metoda të ndryshme analizash pasuese (siç janë spektrometria masive, Western blot, etj.).

aplikimi i bashkë-imunoprecipitimit (Co-IP)

Ndërveprimi proteinë-proteinë

Co-IP përdoret shpesh për të studiuar bashkëveprimin midis proteinave në qeliza, duke zbuluar se si ato punojnë së bashku në procese biologjike siç janë transduksioni i sinjalit dhe rregullimi i shprehjes së gjeneve.

Identifikimi i Kompleksit

Kompleksi i proteinave i kapur nga Co-IP mund të përdoret për të identifikuar proteina të tjera të panjohura që bashkëveprojnë me proteinën e synuar.

Studime të Funksionit të Proteinave

Duke studiuar rezultatet e Co-IP në kushte të ndryshme, mund të ndihmojë në zbulimin e ndryshimeve në funksionin e proteinave, siç janë ndryshimet në modelet e sëmundjeve.

Alpha Lifetech ofron shërbime të Bashkë-Imunoprecipitimit (Co-IP) për t'u ofruar klientëve mbështetje eksperimentale me cilësi të lartë të bashkë-imunoprecipitimit për të ndihmuar studiuesit të identifikojnë dhe verifikojnë ndërveprimet e proteinave. Shërbimi ynë Co-IP përdor teknologji dhe pajisje të përparuara për të kapur në mënyrë efikase dhe të saktë proteinat e synuara dhe partnerët e tyre ndërveprues. Ne gjithashtu u ofrojmë klientëve dizajn të detajuar eksperimental, analizë të të dhënave dhe raporte për të siguruar besueshmërinë dhe përsëritshmërinë e rezultateve eksperimentale. Përveç kësaj, Alpha Lifetech ofron gjithashtu shërbime të personalizuara për të përmbushur nevojat e veçanta të klientëve dhe është e përkushtuar për të përshpejtuar procesin e kërkimit shkencor të jetës dhe zhvillimit të barnave.

Pyetje të shpeshta

1. Efikasiteti i ulët i Co-IP mund të çojë në rikuperim të pamjaftueshëm të proteinës së synuar.

(1) Problem me cilësinë e antitrupave: përdorni antitrupa me cilësi të lartë dhe shumë specifikë. Antitrupi më i përshtatshëm mund të zgjidhet duke verifikuar efektivitetin dhe specifikën e antitrupit. (2) Afinitet i ulët i antigjenit: përqendrimi i antitrupit mund të optimizohet ose përqendrimi i lizatit qelizor mund të rritet. (3) Kushte të papërshtatshme inkubimi: Sigurohuni që koha e inkubacionit për imunoprecipitim të jetë mjaftueshëm e gjatë, zakonisht 1-2 orë ose më shumë. (4) Përqendrim shumë i ulët i mostrës: Rritni përqendrimin e lizateve qelizore për të siguruar proteina të mjaftueshme të synuara.
2. Precipitati përmban një numër të madh proteinash jo-shënjestër.

(1) Shumë antitrupa: Shumë antitrupa mund të rrisin lidhjen jo-specifike. Mundohuni të zvogëloni përqendrimin e antitrupave. (2) Larje joadekuate: Rritni numrin e hapave të larjes dhe përdorni tampona më të forta larjeje (p.sh., tampona që përmbajnë përqendrime më të larta kripe) për të zvogëluar lidhjen jo-specifike. (3) Tampon lize jo i duhur: Përdorni tamponin e duhur të lizës për të shmangur dëmtimin e tepërt të membranës qelizore, duke rezultuar në çlirimin e proteinave jo-specifike.
3. Proteina e synuar u degradua, duke rezultuar në një sasi të dobët të proteinës së synuar në precipitat.

(1) Aktiviteti i proteazës: Frenuesit e proteazës shtohen për të parandaluar degradimin e proteinave gjatë lizës. (2) Temperatura e tretësirës së lizës është shumë e lartë: sigurohuni që mostra të përpunohet në akull për të shmangur degradimin e proteinave. (3) Ruajtja jo e duhur: Përpunoni mostrën sa më shpejt të jetë e mundur për të shmangur ruajtjen afatgjatë.
4. Precipitati nuk e përmban plotësisht proteinën ose kompleksin e synuar.

(1) Larje e tepërt: Larja e tepërt mund të largojë proteinën e synuar. Zvogëloni numrin e herëve të larjes për t'u siguruar që kompleksi të mos hollohet tepër. (2) Përqendrim jo i duhur i kripës: Disa bashkëveprime proteinë-proteinë nuk mund të formohen në kushte të larta kripe, prandaj përpiquni të rregulloni përqendrimin e kripës së tretësirës së larjes.
5. Pas imunoprecipitimit, kompleksi antitrup-antigjen ishte i vështirë për t'u eluuar nga sferat magnetike ose sferat e agarozës.

(1) Kushtet e papërshtatshme të elucionit: Për të çliruar komplekset imune përdoren tampona të lehta elucioni (si tampona me pH të ulët ose tampona me kripë të lartë). (2) Afiniteti midis antitrupit dhe antigjenit është shumë i fortë: përdoret temperatura e përshtatshme e elucionit për të shmangur denatyrimin e proteinave të shkaktuar nga temperatura e lartë.

referencë

[1] Maccarrone, G., Bonfiglio, JJ, Silberstein, S., Turck, CW & Martins-de-Souza, D. Karakterizimi i një interaktome proteinike me anë të bashkë-imunoprecipitimit dhe spektrometrisë masive me shkop. në Teknikat e Bioshënjuesve Multipleks: Metodat dhe Zbatimet, 1546, 223–234.

[2] Lin JS, Lai EM. Ndërveprimet Proteinë-Proteinë: Bashkë-Imunoprecipitimi. Methods Mol Biol. 2017;1615:211-219. doi: 10.1007/978-1-4939-7033-9_17. PMID: 28667615.

[3] Tan L, Yammani RR. Bashkë-Imunoprecipitim-Blotting: Analiza e Ndërveprimeve Proteinë-Proteinë. Methods Mol Biol. 2022;2413:145-154. doi:10.1007/978-1-0716-1896-7_15

[4] Evans IM, Paliashvili K. Analizat e bashkë-imunoprecipitimit. Metodat Mol Biol. 2022;2475:125-132. doi:10.1007/978-1-0716-2217-9_8

[5] Gnanasekaran P, Pappu HR. Teknika e Pastrimit të Afinitetit - Spektroskopia e Masës (AP-MS) dhe Teknika e Bashkë-Imunoprecipitimit (Co-IP) për të Studimin e Ndërveprimeve Proteinë-Proteinë. Methods Mol Biol. 2023;2690:81-85. doi:10.1007/978-1-0716-3327-4_7