Protokolli i Prodhimit të Antitrupave Fab dhe Pyetjet e Shpeshta

Antitrupi Fab (antitrupi fragment) i referohet pjesës së molekulës së antitrupit që mund të lidhet me antigjenin. Ai përbëhet nga një rajon konstant dhe një rajon variabël në një zinxhir të lehtë të plotë dhe një zinxhir të rëndë. Antitrupi Fab ruan aftësinë specifike të lidhjes së antitrupit. Krahasuar me antitrupin me gjatësi të plotë, antitrupi Fab ka aftësi më të mirë depërtimi në inde dhe imunogjenitet më të ulët. Përveç kësaj, antitrupat Fab nuk aktivizojnë komplementet ose nuk shkaktojnë citotoksicitet të ndërmjetësuar nga qelizat (ADCC) të varur nga antitrupat përmes receptorëve Fc për shkak të mungesës së segmenteve Fc, gjë që ka përparësi në disa skenarë trajtimi.

Parimi i Prodhimit të Antitrupave Fab

Ekstraktimi enzimatik i fragmentit Fab

Antitrupi i plotë IgG çahet në një vend specifik nga një proteazë specifike për të çliruar në mënyrë selektive fragmentin Fab:

Papain

Në prani të kushteve reduktuese (p.sh., në prani të cisteinës), rajoni i varjes së IgG-së çahet për të gjeneruar dy fragmente Fab (secili përmban një zinxhir të lehtë të plotë dhe një zinxhir të rëndë pjesërisht) dhe një fragment Fc.

Pepsinë

IgG zakonisht ndahet në fragmente F(ab')2 (dy Fab janë të lidhura me anë të lidhjeve disulfide) dhe fragmente Fc të degraduara në kushte jo-reduktuese, dhe kërkohet reduktim i mëtejshëm për të përftuar një Fab të vetëm.

Prodhimi i fragmentit Fab me anë të shprehjes rekombinante

Vektori i shprehjes që mbante gjenin Fab u ndërtua me anë të inxhinierisë gjenetike, dhe fragmenti Fab u shpreh dhe u mblodh nga qelizat pritëse (si E. coli dhe qelizat e gjitarëve):

Dizajni i gjenit

Gjenet e antitrupave të zinxhirit të rëndë (VH + CH1) dhe zinxhirit të lehtë (VL + CL) u klonuan përkatësisht, dhe peptidi sinjalizues (siç është sekretimi i udhëhequr nga pelB në zgavrën periplazmike), përputhja e lidhjes disulfide dhe etiketa (siç është etiketa His) u futën për të ndihmuar pastrimin.

Sistemi i bashkë-shprehjes

Zinxhiri i lehtë dhe zinxhiri i rëndë shprehen në të njëjtën kohë, dhe Fab është palosur saktë nga lidhja disulfide dhe bashkëveprimi hidrofobik.

Avantazhet e Antitrupave Fab

Madhësi e vogël

Antitrupat Fab janë më të vegjël se antitrupat me gjatësi të plotë, gjë që u lejon atyre të depërtojnë më lehtë në inde, duke përfshirë edhe indet tumorale. Kjo përshkueshmëri është veçanërisht e dobishme për diagnostikimin dhe trajtimin e lezioneve të indeve të thella.

Zhdoganim i shpejtë

Për shkak të madhësisë së tyre të vogël, antitrupat Fab zakonisht kanë një gjysmë-jetë më të shkurtër në trup, gjë që mund të zvogëlojë efektet anësore të mundshme dhe të ofrojë kontrast më të lartë gjatë procesit diagnostikues. Përveç kësaj, pastrimi i shpejtë mund të ndihmojë gjithashtu në uljen e rrezikut të imunogjenitetit.

Specifikimi dhe afiniteti

Pavarësisht madhësisë së tyre të vogël, antitrupat Fab ruajnë ende specifikë dhe afinitet të lartë për t'u lidhur me antigjenet. Kjo i bën ato shumë premtuese për aplikimet që kërkojnë njohje me specifikë të lartë, siç është administrimi i synuar i barnave.

Fleksibiliteti i prodhimit

Antitrupat Fab mund të prodhohen përmes sistemeve mikrobike si bakteret ose maja, dhe kostoja e tyre e prodhimit është më e ulët dhe shpejtësia është më e shpejtë krahasuar me kulturën qelizore të gjitarëve që mbështetet tërësisht në antitrupa. Përveç kësaj, antitrupat Fab mund të modifikohen përmes teknikave të inxhinierisë gjenetike për të rritur stabilitetin dhe funksionalitetin e tyre.

Hapat e Prodhimit të Antitrupave Fab

Përgatitja e antitrupit Fab me anë të tretjes enzimatike

Pastrimi i antitrupave

Antitrupat IgG u pastruan nga supernatantet e kulturës qelizore ose serumi duke përdorur një kolonë proteine A/G. IgG u mblodh pas lidhjes dhe elucionit.

Tretja enzimatike

Tretësira IgG u përzie me papainë dhe u inkubua në kushte të optimizuara tamponi (siç është PBS në pH 7.0). Koha dhe temperatura e tretjes duhet të optimizohen sipas antitrupit specifik dhe kushteve eksperimentale, përgjithësisht në 37 °C për 1-4 orë.

Ndarja dhe pastrimi

SDS-PAGE u përdor për të zbuluar efektin e tretjes për t'u siguruar që segmenti Fab ishte i paprekur pa u thyer. Fragmenti Fab u izolua nga përzierja e tretjes me anë të kromatografisë së shkëmbimit jonik ose kromatografisë së përjashtimit të madhësisë.

Zbulimi i cilësisë

SDS-PAGE, Western blot ose spektrometria masive u përdorën për të konfirmuar cilësinë e fragmentit të pastruar Fab. Aktiviteti lidhës i Fab u zbulua me anë të ELISA ose rezonancës sipërfaqësore të plazmonit (SPR).

Figura 1. Paraqitje skematike e produkteve të tretjes së papainës mab, fragmenteve të antitrupave Fab dhe Fc. (Burimi i referencës: Pastrimi i fragmenteve Fab nga një tretje papaine e antitrupave monoklonalë me anë të elektroforezës Gradiflow.）

Përgatitja e Antitrupave Fab me anë të Inxhinierisë Gjenetike

Klonimi i gjeneve

Gjenet e rajoneve variabile të zinxhirit të lehtë dhe zinxhirit të rëndë (VL dhe VH) të antitrupit të synuar u nxorën. Dy sekuencat e gjeneve u amplifikuan me PCR dhe u shtua gjeni i duhur i peptidit lidhës.

Ndërtimi i vektorit

Gjenet VL dhe VH u futën në vektorin e shprehjes. Sigurohuni që vektori të ketë një promotor dhe shënues përzgjedhjeje të përshtatshëm për strehuesin e synuar.

Shprehja dhe shqyrtimi

Vektori rekombinant u transferua në një qelizë pritëse të përshtatshme (si E. coli ose maja). Antitrupi Fusion Fab u induktua për ta shprehur dhe shfaqja e Fab u shqyrtua nga membrana najloni.

Ndarja dhe pastrimi

Fab-et mund të pastrohen nga supernatantet e kulturës ose ekstraktet qelizore duke përdorur kromatografinë e afinitetit Ni-NTA (nëse Fab është i etiketuar me His). Eluimi i temperaturës dhe rikuperimi i antitrupave Fab.

Verifikimi i performancës

Vlerësimi funksional i Fab, duke përfshirë testin e lidhjes së antigjenit (si ELISA, SPR).

aplikimi i antitrupave Fab

Diagnoza mjekësore

Antitrupat Fab përdoren gjerësisht në diagnostikimin imazherik, siç është skanimi PET dhe skanimi SPECT. Karakteristika e tyre e shpejtë e pastrimit lejon që të arrihet imazheria me kontrast të lartë në një periudhë të shkurtër kohore, duke përmirësuar kështu saktësinë diagnostikuese.

Përdorim terapeutik

Në fushat e kancerit, sëmundjeve infektive dhe sëmundjeve autoimune, antitrupi Fab tregon një perspektivë të mirë aplikimi si një terapi e vetme ose e kombinuar me trajtime të tjera.

Mjetet e kërkimit

Në fushat e biologjisë molekulare dhe bioteknologjisë, antitrupat Fab shërbejnë si mjete kërkimore për identifikimin dhe kapjen e proteinave të synuara, duke ofruar mbështetje të fortë për kërkimin bazë dhe zhvillimin e barnave.

Biosensorë

Për shkak të specifikës dhe fleksibilitetit të lartë të antitrupave Fab, ato përdoren për të zhvilluar biosensorë për zbulimin e ndotësve në industrinë ushqimore dhe ndotësve kimikë në shkencën mjedisore.

Alpha Lifetech ofron testime të prodhimit të antitrupave Fab të projektuara posaçërisht për të përmbushur nevojat komplekse të industrisë së bioteknologjisë. Metoda jonë e zbulimit është projektuar me kujdes për të siguruar rendiment dhe pastërti të lartë të fragmentit Fab, duke u ofruar studiuesve një mjet të besueshëm për zhvillimin e antitrupave.

Pyetje të shpeshta

1. Kur përdoret metoda e tretjes me enzima, problemi i zakonshëm është se tretja jo e plotë enzimatike çon në rendiment të ulët të segmenteve Fab, ose tretja e tepërt dëmton segmentet Fab.

Zgjidhja: Optimizoni llojin, përqendrimin, kohën e inkubacionit dhe temperaturën e enzimës. Kushtet optimale të tretjes mund të përcaktohen me anë të eksperimenteve të gradientit për të siguruar marrjen e segmenteve Fab me pastërti të lartë.
2. Si metodat e tretjes enzimatike ashtu edhe ato të inxhinierisë gjenetike mund të kenë problemin e prodhimit të ulët të antitrupave Fab.

Zgjidhja: Për metodën e tretjes me enzimë, kontrolloni pastërtinë dhe përqendrimin e IgG-së dhe optimizoni kushtet e tretjes. Për inxhinierinë gjenetike, mund të jetë e nevojshme të optimizohet sistemi i shprehjes, duke përfshirë rritjen e numrit të replikimit të vektorit, rritjen e forcës së promotorit ose ndryshimin e llojit pritës (siç është kalimi nga shprehja e E.coli në atë të majasë).
3. Antitrupi Fab i përgatitur nuk mundi të lidhej në mënyrë efektive me antigjenin e synuar.

Zgjidhja: Vlerësoni dhe përmirësoni saktësinë e dizajnit Fab për të siguruar saktësinë e sekuencës së rajonit të ndryshueshëm të klonuar. Në të njëjtën kohë, procesi i shprehjes rekombinante të Fab u optimizua, siç është rregullimi i kushteve të palosjes dhe metodave të pastrimit për të shmangur heqjen e epitopeve kryesore.
4. Në procesin e pastrimit, antitrupi Fab mund të kontaminohet nga proteina të tjera.

Zgjidhja: Rritni saktësinë dhe selektivitetin e hapave të pastrimit, siç është kombinimi i kromatografisë me përjashtim të madhësisë dhe shkëmbimit jonik, duke përdorur kromatografinë me afinitet me performancë të lartë. Nëse etiketohet, kromatografia e afinitetit të kelatit të metalit (IMAC) mund të përdoret për të përmirësuar pastërtinë.
5. Qelizat pritëse nuk mund t’i shprehin në mënyrë efektive antitrupat Fab.

Zgjidhja: Provoni lloje të ndryshme të qelizave pritëse (siç janë E.coli, Pichia pastoris, qelizat CHO) dhe optimizoni kushtet e kultivimit, siç janë temperatura, lëndët ushqyese, përqendrimi i induktorit, etj.

referencë

[1] Mizote Y, Masumi-Koizumi K, Katsuda T, Yamaji H. Prodhimi i një fragmenti Fab të antitrupave duke përdorur peptidin 2A në qelizat e insekteve. J Biosci Bioeng. 2020;130(2):205-211. doi:10.1016/j.jbiosc.2020.03.009

[2] Hussain H, Patel T, Ozanne AMS, etj. Një analizë krahasuese e prodhimit të Fab rekombinant dhe antitrupave me gjatësi të plotë në qelizat e vezoreve të hamsterit kinez. Biotechnol Bioeng. 2021;118(12):4815-4828. doi:10.1002/bit.27944

[3] Ohmuro-Matsuyama Y, Mori K, Hamada H, Ueda H, Yamaji H. Inxhinieria elektrostatike e ndërfaqes midis zinxhirëve të rëndë dhe të lehtë nxit prodhimin e fragmenteve Fab të antitrupave. Cytotechnology. 2017;69(3):469-475. doi:10.1007/s10616-016-9955-4

[4] Ohmuro-Matsuyama Y, Mori K, Hamada H, Ueda H, Yamaji H. Inxhinieria elektrostatike e ndërfaqes midis zinxhirëve të rëndë dhe të lehtë nxit prodhimin e fragmenteve Fab të antitrupave. Cytotechnology. 2017;69(3):469-475. doi:10.1007/s10616-016-9955-4

[5] Valedkarimi Z, Nasiri H, Aghebati-Maleki L, Abdolalizadeh J, Esparvarinha M, Majidi J. Prodhimi dhe karakterizimi i fragmentit të antitrupave anti-human IgG F(ab')2. Antitrupat Hum. 2018; 26 (4): 171-1 doi: 10.3233/HAB-180336

[6] Nasiri H, Valedkarimi Z, Aghebati-Maleki L, etj. Prodhimi dhe pastrimi i antitrupave poliklonalë kundër fragmentit F(ab')2 të imunoglobulinës njerëzore G. Vet Res Forum. 2017;8(4):307-312.

[7] Coleman L, Mahler SM. Pastrimi i fragmenteve Fab nga një tretës papaine me antitrup monoklonal me anë të elektroforezës Gradiflow. Protein Expr Purif. 2003;32(2):246-251. doi:10.1016/j.pep.2003.07.005