Protokolli dhe Pyetjet e Shpeshta për Citometrinë me Fluks (FCM/FC)

Citometria me rrjedhje është një teknologji e re e zhvilluar në fund të viteve 1960, e cila përdor citometrin me rrjedhje për të analizuar shpejt dhe në mënyrë sasiore karakteristikat fizike dhe kimike të popullatës qelizore dhe për të renditur me saktësi qelizat sipas këtyre karakteristikave fizike dhe kimike. Ajo përfshin kryesisht dy pjesë: analizën e rrjedhjes dhe renditjen me rrjedhje. Citometria me rrjedhje pasqyron karakteristikat fizike dhe kimike të qelizave duke marrë sinjale të dritës së shpërndarë dhe sinjale fluoreshente pas rrezatimit me lazer të qelizave në rrjedhje, të tilla si madhësia e qelizave, madhësia e grimcave dhe shprehja e molekulave të antigjenit.

Parimi i Citometrisë së Fluksit

Rrezja lazer me një gjatësi vale specifike ndriçon drejtpërdrejt qelizat në rrjedhën e lëngut të drejtuar nga presioni i lartë, dhe sinjali optik i gjeneruar merret nga marrës të shumtë. Njëri është sinjali i dritës së shpërndarë (shpërndarja këndore përpara) i marrë në drejtimin linear të rrezes lazer, dhe tjetri është sinjali i dritës i marrë në drejtimin vertikal të rrezes lazer, duke përfshirë sinjalin e dritës së shpërndarë (shpërndarja këndore anësore) dhe sinjalin e fluoreshencës. Qelizat ose grimcat me një diametër prej 0.2 ~ 150 μm të pezulluara në rrjedhën e lëngut mund ta shpërndajnë rrezen lazer, dhe fluoreshenca e lidhur në qeliza mund të lëshojë fluoreshencë pasi të ngacmohet nga lazeri. Sinjali i dritës së shpërndarë dhe sinjali i fluoreshencës merren nga marrësi përkatës, dhe karakteristikat fizike dhe kimike të secilës qelizë mund të reflektohen sipas luhatjes së sinjalit të marrë.

Citometria me rrjedhje ka tre elementë kryesorë, përkatësisht, citometrinë me rrjedhje, qelizat e mostrës dhe ngjyrat fluoreshente ose antitrupat e konjuguar me fluoresceinë.

Objekti i citometrisë me rrjedhë ishte pezullimi i qelizave të vetme. Citometria me rrjedhë nuk mund të zbulojë drejtpërdrejt qelizat në blloqe indesh. Për të zbuluar qelizat në organe ose inde, organet ose indet duhet të përgatiten në pezullime të qelizave të vetme me metoda të ndryshme dhe më pas të etiketohen me antitrupa të konjuguar me fluoresceinë përpara se të mund të zbulohen me anë të citometrisë me rrjedhë. Citometria me rrjedhë nuk mund të zbulojë drejtpërdrejt molekulat, por mund të zbulojë indirekt molekulat duke përdorur grimca sintetike në vend të qelizave dhe më pas duke kombinuar antitrupin e molekulës me grimca artificiale, siç është metoda CBA për të zbuluar citokinat.

Hapat e Citometrisë së Fluksit

Përgatitja e mostrës

Përgatitja e mostrës është një nga hapat më kritikë në eksperimentet e citometrisë me rrjedhje. Sigurimi i cilësisë së pezullimit qelizor ndikon drejtpërdrejt në saktësinë e rezultateve eksperimentale. Hapat specifikë janë si më poshtë:

Ndarja e qelizave

Qelizat u nxorën nga indet ose gjaku, të cilat mund të izolohen paraprakisht me anë të centrifugimit, shqyrtimit të qelizave dhe metodave të tjera.

Numërimi i qelizave

Përqendrimi i duhur i qelizave (përgjithësisht 1 × 10 deri në 1 × 10 qeliza / ml) sigurohet me anë të numërimit mikroskopik ose instrumenteve të numërimit automatik të qelizave. Pastrimi i qelizave: Ndonjëherë qelizat duhet të pastrohen për të hequr papastërtitë dhe proteinat e mundshme në tretësirë, duke zvogëluar ndërhyrjen në rezultatet e analizës. Qelizat lahen me tampon PBS.

Fiksimi i qelizave (opsional)

Nëse duhet të analizohen përbërësit e brendshëm të qelizës, qeliza mund të duhet të fiksohet. Fiksuesit e përdorur zakonisht si formaldehidi, etanoli etj.

Etiketimi i qelizave

Etiketimi i qelizave me antitrupa fluoreshente ose ngjyra të tjera fluoreshente për të zbuluar molekula specifike në sipërfaqen e qelizës ose në qelizë gjatë analizës pasuese.

Injektimi i mostrës

Suspensioni qelizor i trajtuar u fut në tubin e mostrës së citometrit të rrjedhës. Suspensioni qelizor futet në një citometër rrjedhës përmes një tubi shumë të hollë (zakonisht një tub me madhësi mikroni). Qelizat drejtohen në një gjendje rrjedhjeje laminare me një qelizë të vetme gjatë rrjedhës.

Rrezatimi me lazer

Kur qelizat rrjedhin përmes citometrit të rrjedhës, rrezja lazer do të rrezatojë secilën qelizë. Gjatësia e valës së lazerit zgjidhet sipas kërkesave eksperimentale dhe karakteristikave të shënuesit fluoreshent. Gjatësitë e valës së lazerit që përdoren zakonisht janë 488 nm, 633 nm, etj.

Ngacmimi i etiketimit me fluoreshencë

Shënuesit fluoreshentë në sipërfaqe ose brenda qelizës do të ngacmohen nga lazeri dhe do të lëshojnë fluoreshencë përkatëse. Çdo shënues fluoreshent lëshon sinjale të ndryshme fluoreshence në një gjatësi vale specifike.

Dritë shpërndarëse

Përveç fluoreshencës, shpërndarja e lazerit nga qelizat është gjithashtu një sinjal i rëndësishëm për analizën e citometrisë me rrjedhje. Shpërndarja e dritës mund të ofrojë informacion në lidhje me vetitë fizike të qelizave, veçanërisht madhësinë dhe madhësinë e grimcave të qelizave.

Zbulimi i sinjalit optik

Pas rrezatimit me lazer, qelizat prodhojnë një sërë sinjalesh optike, duke përfshirë dritën e shpërndarë dhe sinjalet e dritës fluoreshente. Citometri i rrjedhës është i pajisur me detektorë dhe filtra të shumtë optikë për të analizuar këto sinjale.

Drita shpërndarëse përpara (FSC)

Intensiteti i dritës që shpërhapet përpara lidhet me madhësinë (vëllimin) e qelizës. Sa më e madhe të jetë qeliza, aq më i fortë është intensiteti i dritës që shpërhapet përpara. Drita e shpërndarë përpara zakonisht përdoret për të matur madhësinë e qelizave.

Drita e shpërndarë anësore (SSC)

Intensiteti i dritës së shpërndarë anësore lidhet me madhësinë e grimcave të qelizës (siç është kompleksiteti strukturor brenda qelizës). Qelizat me madhësi më të lartë të grimcave (siç janë qelizat e bardha të gjakut) prodhojnë dritë më të fortë të shpërndarjes anësore. Drita e shpërndarë anësore përdoret për të analizuar strukturën e brendshme të qelizave.

Sinjal fluoreshence

Citometri i rrjedhës është i pajisur me detektorë të shumtë fluoreshence, secili prej të cilëve është përgjegjës për kapjen e sinjaleve të fluoreshencës në diapazone të ndryshme gjatësie vale. Çdo shënues fluoreshent ka një gjatësi vale specifike të emetimit, dhe këto sinjale kapen dhe analizohen nga një filtër dhe detektor i përshtatshëm.

Përpunimi i sinjalit dhe analiza e të dhënave

Sinjalet e zbuluara të dritës së shpërndarë dhe fluoreshencës shndërrohen në sinjale dixhitale me anë të citometrisë me rrjedhë dhe përpunohen e analizohen me kompjuter. Përpunimi i të dhënave zakonisht ndahet në hapat e mëposhtëm:

Konvertimi i sinjalit

Të gjitha sinjalet optike (drita e shpërndarë dhe drita fluoreshente) shndërrohen në sinjale elektrike, amplifikohen nga një amplifikator elektronik dhe më pas shndërrohen në sinjale dixhitale për përpunim.

Mbledhja e të dhënave

Softueri kompjuterik merr të dhënat e secilës qelizë dhe i ruan ato. Sinjalet e dritës së shpërndarjes përpara, dritës së shpërndarjes anësore dhe fluoreshencës së secilës qelizë u regjistruan për të formuar një grup të plotë të të dhënave shumëdimensionale.

Analiza e të dhënave

Sipas qëllimit të eksperimentit, softuerët mund të përdoren për analiza të ndryshme. Për shembull, molekulat specifike në qeliza mund të përcaktohen në mënyrë sasiore nga intensiteti i fluoreshencës, ose llojet e ndryshme të popullatave qelizore mund të dallohen nga intensiteti i dritës së shpërndarë.

Interpretimi dhe Vizualizimi i Rezultateve

Të dhënat e gjeneruara nga citometria me rrjedhje zakonisht shfaqen përmes grafikëve (si histograma, grafikë shpërndarjeje, harta dendësie, etj.). Rezultatet e zakonshme të analizës përfshijnë:

Shpërndarja e popullatave qelizore

Shpërndarja e popullatave të ndryshme qelizore në dritën e shpërndarjes përpara dhe anësore u analizua me anë të grafikut të shpërndarjes. Lloje të ndryshme qelizash (si limfocitet, monocitet, etj.) tregojnë modele të ndryshme shpërndarjeje.

Zbulimi i ngjyrave fluoreshente

Shprehja e molekulave specifike në sipërfaqen e qelizës ose brenda saj u analizua nga shpërndarja e sinjaleve të fluoreshencës. Për shembull, përdorimi i antitrupave të etiketuar me anti-CD mund të hartëzojë hartën e intensitetit të fluoreshencës së një popullate specifike qelizash imune.

Analiza e ciklit qelizor

Statusi i ciklit qelizor (si faza G0/G1, faza S, faza G2/M, etj.) u analizua nga sinjalet fluoreshente të ngjyrave të ADN-së (si PI, DAPI).

Figura 1. Krahasim skematik i një zbulimi konvencional dhe spektral në citometrinë me rrjedhje. (Burimi i referencës: Citometria e rrjedhës spektrale.)

Zbatimi i Citometrisë së Fluksit

Citometria me rrjedhje përdoret gjerësisht në shkencat e jetës, mjekësi, kërkimin e barnave dhe fusha të tjera. Zbatimet e zakonshme përfshijnë:

Analiza imunofenotipike

Duke etiketuar antigjene të ndryshme, ndihmon në përcaktimin e karakteristikave imune të popullatës qelizore.

Analiza e Ciklit Qelizor

Ndihmon në studimin e përhapjes së qelizave dhe statusit të ciklit qelizor duke etiketuar ADN-në.

Analiza e Qëndrueshmërisë së Qelizave

Proceset fiziologjike si qëndrueshmëria e qelizave, apoptoza dhe autofagjia u vlerësuan.

Renditja e qelizave

Renditje e saktë bazuar në karakteristikat e ndryshme të qelizave për kërkime të mëtejshme.

Alpha Lifetech ka shumë vite përvojë në projekte. Me përgatitjen e saj të thellë teknike dhe ekipin profesional, ajo mund t'u ofrojë klientëve shërbime të personalizuara. Alpha Lifetech ofron shërbime të Citometrisë me Fluks (FCM / FC) për të përmbushur nevojat kërkimore shkencore dhe klinike të klientëve.

Pyetje të shpeshta

1. Agregimi i qelizave çon në formimin e sinjaleve mbivendosëse të qelizave të shumëfishta në instrument, gjë që ndikon në saktësinë e të dhënave.

Shkaku: përqendrimi i qelizave është shumë i lartë ose shumë i ulët. Qelizat janë dëmtuar ose janë ngjitur gjatë trajtimit. Mostra mund të përmbajë papastërti ose grumbuj qelizash të pashpërndara. Zgjidhje: (1) Hollimi i duhur i qelizave: sigurohuni që përqendrimi i qelizave të jetë brenda diapazonit të rekomanduar të instrumentit, zakonisht nga 1 × 10 Ω në 1 × 10 Ω qeliza / mL. (2) Përdorimi i agjentëve deagregues: një sasi e përshtatshme e agjentëve deagregues, siç janë DNase, EDTA, etj., mund të shtohet për të ndihmuar në shpërndarjen e qelizave. (3) Optimizimi i trajtimit të mostrës: Përdorni funksionimin steril për të shmangur lëkundjen e tepërt ose përdorni forcë centrifugale shumë të fortë. (4) Filtrim i përshpejtuar: Sitat e qelizave (p.sh., sita me hapje 70 μm ose 40 μm) përdoren për të filtruar mostrat para citometrisë së rrjedhës për të hequr grumbujt e mëdhenj të qelizave dhe papastërtitë.
2. Antitrupat ose ngjyruesit e etiketuar me fluoreshencë mund të shkaktojnë ngjyrosje të pabarabartë dhe të ndikojnë në besueshmërinë e të dhënave, veçanërisht në eksperimentet me shumë etiketa.

Shkaku: hapa të papërshtatshëm ngjyrosjeje ose kohë shumë e shkurtër. Përqendrimi i ngjyruesit është shumë i lartë ose shumë i ulët. Dëmtim ose përshkueshmëri e dobët gjatë përpunimit të qelizave. Zgjidhje: (1) Optimizimi i kushteve të ngjyrosjes: Rregulloni përqendrimin dhe kohën e ngjyrosjes sipas manualit të reagentit dhe zakonisht sigurohuni që reaksioni i ngjyrosjes të jetë brenda temperaturës dhe intervalit kohor të duhur. (2) Përdorni hapat e duhur të larjes: Pas ngjyrosjes, hiqni ngjyruesit e palidhur ose antitrupat me anë të larjes adekuate. (3) Përdorni ngjyrues të përshtatshëm: Zgjidhni ngjyrues dhe antitrupa që përputhen me qëllimin eksperimental për të siguruar specifikën dhe ndjeshmërinë e tyre. Para-eksperiment: Para eksperimentit formal, u krye një para-eksperiment në shkallë të vogël për të optimizuar kushtet e ngjyrosjes dhe përqendrimin e ngjyruesit.
3. Zhurmë e lartë në sfond.

Shkaku: Lidhja jo-specifike e ngjyrave fluoreshente. Në mostër ka qeliza ose grimca jo-shënjestër. Vendosja jo e duhur e lazerit dhe detektorit. Zhurma e lartë në sfond do të ndikojë në saktësinë e rezultateve eksperimentale, duke e bërë të vështirë dallimin e sinjalit të synuar nga sinjali i sfondit. Zgjidhjet: (1) Rregulloni përqendrimin e ngjyrave fluoreshente: shmangni përdorimin e ngjyrave të tepërta fluoreshente dhe zvogëloni lidhjen jo-specifike. (2) Optimizoni përzgjedhjen e antitrupave: Përdorni antitrupa me afinitet të lartë për të zvogëluar sinjalet e sfondit. (3) Përdorni mostrat e kontrollit: Vlerësoni sinjalet e sfondit me anë të kontrolleve negative, negative ose izotipike për të ndihmuar në dallimin midis sinjaleve specifike dhe zhurmës së sfondit. (4) Kalibrimi i lazerit dhe filtrit: Sigurohuni që cilësimet e lazerit dhe filtrit të instrumentit janë të sakta dhe minimizoni ndikimin e zhurmës së sfondit.
4. Përzgjedhja e antitrupave dhe reaksioni i kryqëzuar: Në eksperimentet e shumëfishta të etiketimit, mund të ndodhin reaksione të kryqëzuara midis antitrupave të ndryshëm, duke rezultuar në vështirësi në interpretimin e të dhënave.

Shkaku: Reaktivitet i kryqëzuar midis antitrupave të përzgjedhur në mënyrë të papërshtatshme ose antitrupave të etiketuar me fluoreshencë. Spektrat e emetimit të ngjyruesve mbivendosen. Zgjidhjet: (1) Zgjidhni antitrupa me specifikë të lartë: Përdorni antitrupa të verifikuar me afinitet të lartë për të siguruar specifikën e tyre. (2) Shmangni mbivendosjen e ngjyruesve: Zgjidhni ngjyrues fluoreshente me spektra të ndryshëm emetimi për të shmangur mbivendosjen e sinjalit midis ngjyruesve të ndryshëm. (3) Duke përdorur sekuencën e duhur të etiketimit: Rendi i etiketimit të antitrupave u rregullua në mënyrë të arsyeshme sipas rendit të spektrave të ngacmimit dhe emetimit të ngjyruesve fluoreshente.

referencë

[1] McKinnon KM. Citometria e rrjedhës: Një përmbledhje. Curr Protoc Immunol. 2018;120:5.1.1-5.1.11. Botuar më 21 shkurt 2018. doi:10.1002/cpim.40

[2] Givan AL. Citometria me rrjedhje: një hyrje. Metodat Mol Biol. 2011;699:1-29. doi:10.1007/978-1-61737-950-5_1

[3] Nolan JP, Condello D. Citometria me rrjedhje spektrale. Curr Protoc Cytom. 2013; Kapitulli 1:1.27.1-1.27.13. doi:10.1002/0471142956.cy0127s63

[4] Maciorowski Z, Chattopadhyay PK, Jain P. Citometria Bazë Shumëngjyrëshe e Rrjedhës. Curr Protoc Immunol. 2017;117:5.4.1-5.4.38. Botuar më 3 Prill 2017. doi:10.1002/cpim.26

[5] Darzynkiewicz Z, Bedner E, Smolewski P. Citometria me rrjedhje në analizën e ciklit qelizor dhe apoptozës. Semin Hematol. 2001;38(2):179-193. doi:10.1016/s0037-1963(01)90051-4