Protokolli i Hibridizimit In Situ me Fluoreshencë dhe Pyetjet e Shpeshta

Hibridizimi fluoreshent in situ (FISH) është një teknikë e biologjisë molekulare që përdoret për të zbuluar dhe lokalizuar vendndodhjen e sekuencave specifike të acideve nukleike (si ADN-ja ose ARN-ja) në qeliza ose seksione indesh. Kjo teknologji përdoret gjerësisht në gjenomikë, citologji dhe kërkime patologjike, veçanërisht në lokalizimin e gjeneve, analizën e anomalive të kromozomeve dhe zbulimin e shprehjes së gjeneve.

Parimi i PESHKUT

Sondat e acidit nukleik të shënuara me fluoreshencë përdoren për të hibridizuar me sekuencat e ADN-së ose ARN-së së synuar në mostrat e qelizave ose indeve për të lokalizuar dhe zbuluar sekuenca specifike të acidit nukleik në nivel molekular. FISH është një teknikë shumë e ndjeshme dhe shumë specifike që mund të identifikojë dhe shfaqë me saktësi vendndodhjen e gjenit ose ARN-së së synuar në qeliza ose seksione të indeve.

Hapat e eksperimentit FISH (hibridizimi fluoreshent in situ)

Përgatitja e mostrës

Përpara se të fillojnë eksperimentet FISH, duhet të përgatiten mostrat, zakonisht prerje qelizash ose indesh.

Përgatitja e qelizave ose indeve

Zgjidhni mostrat e duhura të qelizave ose indeve. Burimet e zakonshme përfshijnë gjakun, prerjet e indeve, kulturën qelizore, etj. Mostra duhet të ruajë strukturën hapësinore origjinale në mënyrë që të lokalizojë me saktësi sekuencën e synuar.

Fiksim

Përdorimi i reagentëve kimikë (si formaldehidi, acidi acetik akullnajor, etj.) për të fiksuar mostrën. Qëllimi i imobilizimit është të mbajë qelizat ose indet në mostër në gjendjen strukturore origjinale për të parandaluar degradimin e qelizave ose acideve nukleike. Metodat e fiksimit që përdoren zakonisht janë: fiksimi me formaldehid 4%, fiksimi me acid acetik akullnajor, etj.

Depërtimi

Pasi mostra të fiksohet, në mënyrë që sonda të depërtojë në qelizë ose ind, zakonisht kërkohet depërtim. Përshkueshmëritë e përdorura zakonisht përfshijnë Triton X-100, Saponin, etj. Këta reagentë mund të shkatërrojnë membranën qelizore dhe të lejojnë sondat e acidit nukleik të hyjnë në qelizë.

Trajtim paraprak i ngrohjes (opsional)

Në disa raste, mostra mund të duhet t'i nënshtrohet trajtimit të denatyrimit termik për të zbërthyer fijet e dyfishta të ADN-së, gjë që lehtëson lidhjen e sondës me sekuencën e synuar.

Dizajnimi dhe Etiketimi i Sondës

Dizajni i sondës

Sondat FISH janë zakonisht acide nukleike të shkurtra me një fije të vetme (ADN ose ARN) që synojnë sekuencat e ADN-së ose ARN-së. Këto sonda duhet të kenë një shkallë të lartë specifikiteti dhe mund të jenë plotësuese të sekuencës së synuar. Sipas nevojave të eksperimentit, projektimi i sondës duhet të marrë në konsideratë specifikën, gjatësinë dhe stabilitetin e gjenit ose sekuencës së synuar.

Etiketimi i sondës

Për të vizualizuar sondën në eksperiment, sonda zakonisht etiketohet me një ngjyrues fluoreshent. Ngjyrat fluoreshente të etiketimit që përdoren zakonisht janë FITC (jeshile), Cy3 (e kuqe), seria Alexa Fluor, etj. Etiketimi i sondës mund të jetë ose etiketim i drejtpërdrejtë (duke lidhur molekulat fluoreshente në fund të sondës) ose etiketim i tërthortë (duke përdorur biotinë ose shënjues të tjerë, dhe më pas duke përdorur etiketimin sekondar të antitrupave).

Hibridizimi

Përgatitja e tretësirës së hibridizimit

Sonda e etiketuar u përzie me një tampon hibridizimi, zakonisht duke përdorur një tampon që përmbante një përqendrim të përshtatshëm kripe dhe tretësi organik, siç është SSC (tamponi kripë-citrat natriumi) ose tamponi Hybe. Sigurohuni që temperatura, përqendrimi i kripës dhe vlera e pH-it të tretësirës së hibridizimit të jenë të përshtatshme për lidhjen e sondës me sekuencën e synuar.

Shtimi i sondës

Tretësira e sondës së etiketuar iu shtua mostrës (siç janë seksionet e indeve ose qelizat). Në këtë kohë, sonda do të hibridizohet me sekuencën e ADN-së ose ARN-së së synuar, dhe hibridizimi zakonisht kryhet në temperatura më të larta (siç janë 37 °C deri në 55 °C). Temperatura specifike rregullohet sipas përmbajtjes së GC-së së sondës dhe karakteristikave të sekuencës së synuar. Zakonisht, koha e hibridizimit është nga disa orë deri në gjatë natës.

Larje

Hiq lidhjen jo-specifike

Pasi të përfundojë reaksioni i hibridizimit, mostra duhet të lahet për të hequr sondën pa lidhje specifike dhe për të zvogëluar sinjalin e sfondit. Procesi i larjes zakonisht përfshin larjen me tampon me përmbajtje të ulët kripe (siç është 2 × SSC), dhe temperatura mund të vendoset në temperaturën e dhomës ose pak më të lartë për të hequr sondat e lidhura jo në mënyrë specifike.

Sinjal i përmirësuar

Në disa raste, mund të përdoren edhe hapa përforcimi, siç është përdorimi i antitrupave sekondarë të etiketuar me antitrupa ose reagentëve të përforcimit të fluoreshencës, për të përmirësuar më tej intensitetin dhe specifikën e sinjalit.

Zbulimi dhe Vëzhgimi i Sinjalit

Vëzhgim me mikroskop fluoreshent

Pas larjes, mostra mund të vëzhgohet me anë të mikroskopit fluoreshent kur të jetë gati. Mikroskopi përdor një filtër të përshtatshëm për të ngacmuar ngjyrën fluoreshente të etiketuar në sondë dhe për të kapur sinjalin e fluoreshencës së emetuar. Ngjyrat e ndryshme fluoreshente kanë gjatësi vale të ndryshme emetimi, kështu që sekuenca të shumëfishta të synuara mund të zbulohen njëkohësisht duke zgjedhur kombinime të ndryshme filtrash.

Fotografimi dhe analiza

Sinjali i fluoreshencës nën mikroskop tregon vendndodhjen e sekuencës së ADN-së ose ARN-së së synuar. Të dhënat eksperimentale mund të ruhen duke fotografuar imazhin, dhe vendndodhja, numri ose modeli i shprehjes së sekuencës së synuar mund të analizohet më tej.

Përpunimi i mëvonshëm dhe analiza e të dhënave

Analiza e imazhit

Analiza sasiore e imazheve fluoreshente u krye duke përdorur softuerë analizimi imazhesh (si ImageJ, Metamorph, etj.) për të vlerësuar forcën e sinjalit, vendndodhjen e sinjalit, etj. Kjo është shumë e rëndësishme për lokalizimin e gjeneve, analizën e shprehjes së gjeneve dhe lokalizimin e sinjaleve të shumëfishta në eksperimente të shumëfishta FISH.

Shpjegimi i rezultatit

Sipas vendndodhjes dhe intensitetit të sinjalit të fluoreshencës, u analizua shpërndarja e gjenit ose ARN-së së synuar në qelizë ose ind. Për shembull, analizohet vendndodhja kromozomale e gjeneve, shpërndarja hapësinore e shprehjes së gjeneve ose ndryshimet gjenetike midis mostrave të ndryshme.

Figura 1. Diagrami skematik i të gjithë procesit cardioFISH. (Burimi i referencës: Protokolli i hibridizimit fluoreshent in situ për kardiomiocitet.)

Llojet tipike të sondave FISH

Sonda e ADN-së

Përdoret për të zbuluar sekuencat e ADN-së, zakonisht përdoret për analizën e lokalizimit të kromozomeve. Numri, struktura dhe lokalizimi i gjeneve të kromozomeve mund të analizohet nga sondat e ADN-së.

Sonda e ARN-së

Përdoret për të zbuluar molekula specifike të ARN-së, zakonisht për analizën e shprehjes së gjeneve. Nëpërmjet sondave të ARN-së, nivelet e shprehjes së gjeneve specifike mund të lokalizohen dhe përcaktohen në mënyrë sasiore në qeliza ose inde.

Sonda Multiplex FISH

Sekuenca të shumëfishta të synuara mund të zbulohen njëkohësisht duke përdorur sonda të etiketuara me fluoreshente me ngjyra të ndryshme. Ky aplikim i sondave të shumëfishta mund të përmirësojë në mënyrë efektive efikasitetin e eksperimentit dhe t'i ndihmojë studiuesit të vëzhgojnë informacionin e lokalizimit të gjeneve ose ARN-së të shumëfishta në të njëjtën kohë.

Specifikimi dhe Ndjeshmëria e Teknikës FISH

Specifikiteti

Specifikiteti i FISH vjen nga komplementariteti midis sondës dhe sekuencës së synuar. Hibridizimi mund të jetë i suksesshëm vetëm kur sonda përputhet plotësisht me sekuencën e synuar. Dizajni i sondave duhet të zgjidhet sipas veçantisë dhe redundancës së sekuencës së synuar për të shmangur hibridizimin jo-specifik.

Ndjeshmëria

FISH mund të zbulojë sekuenca shënjestër me bollëk të ulët sepse sonda e etiketuar mund të lidhet në mënyrë efikase me sekuencën shënjestër dhe mund të zbulojë sinjale jashtëzakonisht të dobëta përmes amplifikimit të sinjalit të fluoreshencës. Kjo lejon që FISH të përdoret jo vetëm për analiza gjenomike në shkallë të gjerë, por edhe për lokalizimin e gjeneve dhe zbulimin e shprehjes në një qelizë të vetme ose në nivel nënqelizor.

Alpha Lifetech ka shumë vite përvojë në projekte, të cilat mund t'i shërbejnë më mirë nevojave të ndryshme të klientëve. Alpha Lifetech ofron shërbime zbulimi të hibridizimit fluoreshent in situ (FISH) për zbulimin dhe lokalizimin e sekuencave specifike të ADN-së ose ARN-së në mostrat e qelizave ose indeve. FISH përdor sonda të etiketuara me fluoreshencë që lidhen me sekuenca plotësuese për të lejuar që shënjues specifikë të gjeneve, kromozomeve ose ARN-së të vizualizohen nën një mikroskop fluoreshent.

Pyetje të shpeshta

1. Në eksperimentet FISH, sinjali i fluoreshencës mund të ndikohet nga lidhja jo-specifike, duke rezultuar në një sinjal sfondi shumë të fortë dhe duke ndikuar në saktësinë e rezultateve.

(1). Kontrolloni rreptësisht kushtet e hibridizimit: sigurohuni që temperatura, përqendrimi i kripës, vlera e pH-it dhe kushtet e tjera të tretësirës së hibridizimit të përmbushin kërkesat e lidhjes së sondës dhe sekuencës së synuar. Temperatura shumë e ulët e hibridizimit mund të shkaktojë që sonda të lidhet me sekuencën jo-synuese, duke rritur kështu sinjalin e sfondit. (2). Optimizoni hapat e larjes: Përdorni kushte të përshtatshme larjeje (siç është përqendrimi më i lartë i kripës së tamponit SSC) për të hequr sondat e lidhjes jo-specifike dhe për të zvogëluar sinjalet e sfondit. Temperatura gjatë larjes zakonisht vendoset në temperaturën e dhomës ose pak më e lartë për të hequr në mënyrë efektive sondën e palidhur. (3). Rritni në mënyrë selektive kohën e larjes: zgjatni kohën e larjes dhe rrisni numrin e larjeve për të siguruar heqjen e sondave të lidhjes jo-specifike. (4). Bllokimi i antitrupave: Mostra bllokohet me reagentë bllokues (si BSA ose protaminë) për të zvogëluar lidhjen jo-specifike.
2. Sinjali i fluoreshencës është i dobët ose sinjali nuk mund të vërehet, duke rezultuar në rezultate eksperimentale të paqarta.

(1) Rritja e përqendrimit të sondës: Nëse sinjali është shumë i dobët, përqendrimi i sondës mund të rritet ose koha e hibridizimit mund të zgjatet, në mënyrë që sonda të mund të lidhet më plotësisht me sekuencën e synuar. (2) Rritja e intensitetit të fluoreshencës së ngjyrave fluoreshente: Zgjidhni ngjyra më të forta fluoreshente (siç janë seria Alexa Fluor, Cy5, etj.), ose përdorni antitrupa sekondarë për të forcuar sinjalin. (3) Optimizimi i kushteve të hibridizimit: Kushtet si përqendrimi i kripës dhe vlera e pH-it të tretësirës së hibridizimit u optimizuan për të siguruar që lidhja e sondës me sekuencën e synuar të ishte më efikase. (4) Rritja e sasisë së sondave të etiketuara: Për eksperimente të shumëfishta FISH, nëse sinjali është i dobët, mund të merrni në konsideratë rritjen e sasisë së sondave të ndryshme fluoreshente për të rritur intensitetin e sinjalit të secilit objektiv.
3. Sonda lidhet në mënyrë jo specifike me sekuencën jo-shënjestër, duke rezultuar në rezultate të pasakta.

(1) Rritja e temperaturës së hibridizimit: Rritja e temperaturës së reaksionit të hibridizimit mund të rrisë lidhjen specifike të sondës me sekuencën e synuar dhe të zvogëlojë lidhjen jo-specifike. Zgjedhja e temperaturës varet nga përmbajtja e GC-së së sondës. Zakonisht, temperatura duhet të optimizohet sipas temperaturës së kalitjes (vlera Tm) të sondës. (2) Optimizimi i dizajnit të sondës: Sigurohuni që sekuenca e dizajnit të sondës është shumë specifike dhe shmangni çiftëzimin plotësues me sekuenca të tjera jo-synuese. (3) Përdorni kushte të përshtatshme larjeje: rrisni rreptësinë e hapave të larjes dhe përdorni një përqendrim më të lartë të tamponit të kripës (siç është 2 × SSC) për të hequr sondat e lidhura jo-specifikisht.
4. Sonda dështoi të hynte në qeliza ose inde në mënyrë efektive, duke rezultuar në dështimin e eksperimentit.

(1) Qeliza të përshkueshme: Mostrat u trajtuan me përshkues të përshtatshëm (si Triton X-100, Saponin, etj.) për të siguruar që sonda të mund të depërtonte në mënyrë efektive në membranën qelizore. Koha dhe përqendrimi i përshkueshmërisë duhet të jenë të përshtatshme për të shmangur dëmtimin e qelizave. (2) Optimizimi i kushteve të përshkueshmërisë: Lloje të ndryshme qelizash ose indesh mund të kërkojnë përshkues ose kushte të ndryshme përshkueshmërie për të testuar metoda të ndryshme përshkueshmërie për të siguruar efektin më të mirë të hyrjes së sondës.
5. Sonda dështoi të hibridizohej me sekuencën e ADN-së ose ARN-së së synuar, duke rezultuar në dështimin e eksperimentit.

(1) Dizajn i optimizuar i sondës: Sigurohuni që sekuenca e sondës është mjaftueshëm plotësuese e sekuencës së synuar dhe zgjidhni gjatësinë e duhur (zakonisht 20-50 çifte bazash) për të përmirësuar efikasitetin e hibridizimit. (2) Rregulloni kushtet e hibridizimit: rregulloni temperaturën e hibridizimit dhe përqendrimin e kripës sipas përmbajtjes së GC-së së sekuencës së synuar, në mënyrë që sonda të mund të lidhet në mënyrë efektive me sekuencën e synuar. Për sekuencat me përmbajtje më të lartë të GC-së, kërkohet temperaturë më e lartë e hibridizimit. (3) Zgjatni kohën e hibridizimit: Rritni kohën e hibridizimit, veçanërisht për sekuencat e synuara me bollëk të ulët, hibridizimi brenda natës mund të merret në konsideratë për të siguruar lidhje të mjaftueshme.

referencë

[1] Bayani J, Squire JA. Hibridizimi fluoreshent in situ (FISH). Curr Protoc Cell Biol. 2004; Kapitulli 22:. doi:10.1002/0471143030.cb2204s23

[2] Chrzanowska NM, Kowalewski J, Lewandowska MA. Përdorimi i Hibridizimit Fluoreshent In Situ (FISH) në Diagnozë dhe Terapi të Përshtatura në Tumoret e Ngurta. Molekulat. 2020;25(8):1864. Botuar më 17 Prill 2020. doi:10.3390/molecules25081864

[3] Gozzetti A, Le Beau MM. Hibridizimi fluoreshent in situ: përdorimet dhe kufizimet. Semin Hematol. 2000;37(4):320-333. doi:10.1016/s0037-1963(00)90013-1

[4] Jiang J. Hibridizimi fluoreshent in situ në bimë: zhvillimet e fundit dhe zbatimet e ardhshme. Chromosome Res. 2019;27(3):153-165. doi:10.1007/s10577-019-09607-z

[5] Yao Z, Bai L, Nie Y. Protokolli i hibridizimit in situ me fluoreshencë për kardiomiocitet. J Mol Cell Cardiol. Botuar në internet më 13 shkurt 2025. doi:10.1016/j.yjmcc.2025.02.003