Protokolli i Imunocitokimisë (ICC) dhe Pyetjet e Shpeshta

Imunocitokimia (ICC) është një teknikë e përdorur për të studiuar proteina specifike, antigjene ose biomolekula të tjera në mostrat qelizore. Teknologjia ICC kombinon specifikën dhe reagimin me ngjyra të antitrupave, e cila përdoret për të lokalizuar dhe zbuluar shprehjen e molekulave intraqelizore ose të sipërfaqes qelizore. Duke përdorur antitrupa specifikë për t'u lidhur me shënjues (siç janë fluoreshenca ose enzima), ICC mund të ofrojë informacion me rezolucion të lartë të lokalizimit të qelizave nën mikroskop, i cili përdoret gjerësisht në kërkimin bazë, diagnostikimin e sëmundjeve dhe ilaçet.

Parimi i Imunocitokimisë

Parimi bazë i ICC është lidhja specifike e antitrupave me antigjenet e tyre të synuara (zakonisht proteina intraqelizore ose specifike për sipërfaqen e qelizës). Vizualizoni shpërndarjen dhe shprehjen e proteinave me anë të fluoreshencës, etiketimit enzimatik ose kimik. Çdo antitrup është një molekulë që synon një antigjen specifik dhe lidhet me një rajon specifik strukturor të antigjenit (zakonisht një epitop antigjeni). Kur antitrupi lidhet me proteinën e synuar, formohet kompleksi antigjen-antitrup. Pastaj kompleksi antitrup-antigjen zbulohet me anë të ngjyrosjes ose etiketimit me fluoreshencë. Zbulimi i këtyre komplekseve mund të vëzhgohet me mikroskop dhe të lokalizohet në zona specifike të qelizës. Shënuesit e përdorur zakonisht përfshijnë:

Etiketimi i enzimave (siç është peroksidaza HRP e rrikës së rrikës): Reaksioni i ngjyrës ndodh pas reagimit me substratin.

Etiketimi me fluoreshencë (si p.sh. FITC, Cy3): Pas ngacmimit, emetohet fluoreshencë për të lehtësuar vëzhgimin nën një mikroskop fluoreshent.

Hapat e imunocitokimisë

Përgatitja e mostrës - Kultura qelizore

Qelizat u mbjellën në enë ose lame të përshtatshme Petri për të siguruar ngjitjen e qelizave ose rritjen e pezullimit. Qelizat u fiksuan me fiksues të përshtatshëm (si 4% paraformaldehid ose metanol) për të ruajtur morfologjinë e qelizave dhe vendndodhjen e molekulave të synuara. Koha e fiksimit dhe përqendrimi duhet të rregullohen sipas llojit të qelizës dhe karakteristikave të proteinës së synuar. Pas kësaj, qelizat duhet të përshkohen. Përshkueshmëria është për të mundësuar që antitrupi të depërtojë në membranën qelizore për të arritur brenda qelizës. Përshkuesit e përdorur zakonisht përfshijnë 0.1% -0.5% Triton X-100 ose 0.1% Tween-20. Koha e përshkueshmërisë është përgjithësisht 10-15 minuta, e rregulluar sipas nevojës. Vendet e lidhjes së antitrupave jo-specifikë u bllokuan me tretësirë bllokuese (si 5% serum normal dhie ose albuminë serumi gjedhi BSA). Koha e mbylljes është zakonisht 30 minuta deri në 1 orë, në temperaturën e dhomës.

Inkubacioni i Antitrupave

Antitrupi primar (antitrup specifik kundër proteinës së synuar) u hollua në tretësirën bllokuese dhe iu shtua mostrës. Koha e inkubacionit është zakonisht 1 orë deri në gjatë natës, dhe temperatura mund të rregullohet sipas kërkesave eksperimentale (zakonisht temperatura e dhomës ose 4℃ gjatë natës). Nëse përdoren antitrupa sekondarë, antitrupat sekondarë të përshtatshëm (siç janë antitrupat e shënuar me enzima ose të shënuar me fluoreshente) duhet të zgjidhen sipas qëllimit eksperimental.

Larje

Mostrat u lanë me tampon PBS ose TBS për të hequr antitrupat e palidhur. Hapat e larjes zakonisht përsëriten 3 herë, 5-10 minuta çdo herë.

Inkubacioni Sekondar i Antitrupave

Nëse përdoret sistemi antitrup primar-antitrup sekondar, atëherë antitrupi sekondar që përmban shënuesin shtohet në mostër. Antitrupi sekondar lidhet me antitrupin primar dhe ofron sinjale të dallueshme (si fluoreshenca ose enzima). Koha e inkubacionit ishte 1 orë në temperaturën e dhomës.

Më në fund larje

Lani përsëri qelizat me tampon PBS ose TBS për të hequr antitrupat sekondarë të tepërt.

Zbulimi i Ngjyrave/Fluoreshencës

Nëse përdoret antitrupi sekondar i shënuar me enzimë (siç është HRP), mund të shtohet tretësira e substratit dhe enzima reagon me substratin për të prodhuar një reaksion me ngjyrë të dukshme.

Nëse përdoret antitrupi sekondar i etiketuar me fluoreshencë, sinjali i etiketuar mund të vëzhgohet drejtpërdrejt nën një mikroskop fluoreshent.

Vulosje

Përdorni një tretësirë vulosëse që përmban një agjent kundër zbehjes për të vulosur filmin, për të parandaluar dobësimin e sinjalit të fluoreshencës dhe për të mbrojtur mostrën për vëzhgim mikroskopik.

Vëzhgim mikroskopik

Qelizat u vëzhguan me anë të një mikroskopi optik ose një mikroskopi fluoreshent për të analizuar lokalizimin dhe shpërndarjen e proteinës së synuar në qeliza.

Shënim 1Përzgjedhja e antitrupave: Zgjedhja e antitrupave të përshtatshëm dhe specifik është çelësi i suksesit të eksperimentit ICC. Siguroni efektivitetin dhe specifikën e antitrupave në qelizat e synuara.
Shënimi 2 Metoda e fiksimit: Fiksuesit e ndryshëm kanë efekte të ndryshme në strukturën e proteinave dhe qelizës. Zgjedhja e fiksuesit të përshtatshëm është thelbësore për ruajtjen e epitopit të antigjenit.
Shënimi 3 Përzgjedhja e etiketimit me fluoreshencë / etiketimit enzimatik: etiketimi me fluoreshencë ose enzimë u zgjodh sipas nevojave të eksperimentit. Etiketimi me fluoreshencë ishte i përshtatshëm për eksperimente të shumëfishta etiketimi, dhe etiketimi enzimatik ishte i përshtatshëm për zbulimin kromogjenik.

Figura 1. Kontrolli i absorbimit është inkubimi i antitrupit primar me antigjenin e përdorur për të gjeneruar antitrupin. (A) Antitrupi primar i inkubuar me antigjene të tepërta lidhet me të gjitha faqet Fab të afta për të lidhur antigjenin në ind (shigjeta). (B) Nëse antigjeni i saktë dhe një antigjen i pasaktë kanë të njëjtin epitop (shigjeta), atëherë lidhja me të dy pengohet nga kontrolli i absorbimit. (C) Në disa raste, antigjeni i adsorbuar nga antitrupi lidhet me proteinat në ind, dhe antitrupi i adsorbuar duket se lidhet me një proteinë. (Burimi i referencës: Kontrollet për imunocitokiminë.)

Avantazhet e imunocitokimisë

Specifikitet i lartë: mund të zbulojë proteina specifike, veçanërisht për lokalizimin dhe përcaktimin sasior të proteinave.

Zgjidhja në nivel qelizor: Mund të vërehet lokalizimi nënqelizor i proteinave intraqelizore.

Analiza sasiore dhe cilësore: E kombinuar me softuerin e analizës së imazhit, niveli i shprehjes së proteinave mund të përcaktohet sasiorisht dhe ndryshimet e shpërndarjes së proteinave në kushte të ndryshme mund të analizohen.

Zbatimi i imunocitokimisë

Lokalizimi i proteinave

Lokalizimi i një proteine specifike në një qelizë (p.sh., membrana qelizore, citoplazma ose bërthama).

Shqyrtimi i drogës

ICC mund të përdoret për të vëzhguar efektin e barnave në molekula ose struktura specifike të qelizave, duke siguruar mbështetje për zhvillimin e barnave.

Hulumtimi i Sëmundjeve

Imunocitokimia përdoret shpesh për të vëzhguar shprehjen dhe shpërndarjen e proteinave të lidhura me sëmundjen në kancer, sëmundje neurodegjenerative dhe studime të tjera.

Alpha Lifetech ofron shërbime të Imunocitokimisë (ICC), i përmbahet kërkesave të klientit, mbështetet në platforma të teknologjisë së përparuar dhe ofron shërbime shkencore gjithëpërfshirëse dhe të personalizuara për të siguruar progresin e qetë dhe përfundimin me cilësi të lartë të projektit.

Pyetje të shpeshta

1. Sinjal i dobët ose asnjë sinjal.

Shkaku: (1) Cilësi e dobët e antitrupave: Antitrupi i përdorur mund të mos jetë shumë specifik ose joefektiv. (2) Përqendrim i papërshtatshëm i antitrupave: përqendrimi shumë i ulët ose shumë i lartë i antitrupave mund të çojë në sinjal të dobët ose zhurmë në sfond. (3) Probleme me procesin e fiksimit: Nëse qeliza nuk është e fiksuar mirë, proteina e synuar mund të humbasë zbulueshmërinë e saj. (4) Depërtim i dobët: Membrana qelizore mund të mos jetë mjaftueshëm e përshkueshme, duke rezultuar në antitrupa që nuk mund të hyjnë në qelizë. Zgjidhje: (1) Përdorni antitrupa me cilësi të lartë dhe të validuar. (2) Përqendrimi u rregullua sipas udhëzimeve të antitrupave dhe eksperimenti i gradientit të përqendrimit u krye. (3) Zgjidhni agjentin e duhur të fiksimit (siç është 4% formaldehid) dhe sigurohuni që koha dhe temperatura e fiksimit të jenë të përshtatshme. (4) Nëse duhet të etiketoni proteinën brenda qelizës, përdorni depërtues të përshtatshëm (siç është 0.1% Triton X-100) për të rritur përshkueshmërinë e membranës qelizore.
2. Sinjal i lartë në sfond.

Shkaku: (1) Lidhje jo-specifike: Antitrupi mund të lidhet me molekula të tjera jo-shënjestruese në qelizë. (2) Problem me antitrupat sekondarë: cilësia e antitrupit sekondar nuk është e mirë ose nuk është e përshtatshme për llojin e qelizës. (3) Larje joadekuate: Antitrupi nuk lahet plotësisht, duke rezultuar në rritje të sinjalit të sfondit. Zgjidhje: (1) Rritni hapin e bllokimit duke përdorur tretësirën e duhur bllokuese (siç është albumina e serumit të gjedhit 5% ose serumi normal i dhisë). Zgjidhni antitrupin sekondar të duhur dhe sigurohuni që ai përputhet me speciet e antitrupit primar. (2) Në hapin e larjes përdoren më shumë tampona larës për të siguruar që antitrupi dhe substancat e lidhjes jo-specifike të hiqen plotësisht.
3. Humbje ose dëmtim i morfologjisë qelizore.

Shkaku: (1) Hapat e fiksimit të papërshtatshëm: Fiksimi i tepërt ose i pamjaftueshëm mund të çojë në ndryshime ose humbje të morfologjisë qelizore. (2) Përdorimi i papërshtatshëm i depërtuesit: Një depërtues shumë i fortë ose shumë i fortë do të shkatërrojë strukturën qelizore. Zgjidhja: (1) Sigurohuni që hapat e fiksimit të kryhen sipas standardit, zakonisht duke përdorur 4% formaldehid ose fiksues të tjerë të përshtatshëm. (2) Shmangni shumë depërtues, rregulloni përqendrimin e depërtuesve ose përdorni lloje të ndryshme depërtuesish.
4. Ngjyrosje e pabarabartë.

Shkaku: (1) Shpërndarje e pabarabartë e qelizave: trajtimi i mostrës nuk është uniform, shpërndarja e qelizave mund të jetë e pabarabartë. (2) Kohë e papërshtatshme e ngjyrosjes: koha e ngjyrosjes është shumë e shkurtër ose shumë e gjatë, duke rezultuar në ngjyrosje të pabarabartë. Zgjidhjet: (1) Sigurohuni që qelizat të jenë të veshura në mënyrë të barabartë në lamë. (2) Koha e ngjyrosjes dhe koha e inkubacionit të antitrupave u optimizuan për të siguruar reagim uniform.
5. Specifikimi i antitrupave.

Shkaku: Antitrupat mund të reagojnë në mënyrë të kryqëzuar me proteina jo-shënjestër në qeliza të tjera. Zgjidhje: U përdorën antitrupat e verifikuar dhe u kryen kontrolle të përshtatshme pozitive dhe negative. Provoni të përdorni antitrupa të tjerë ose antitrupa para-adsorbues për të zvogëluar lidhjen jo-specifike.

referencë

[1] Maxwell P, Salto-Tellez M. Validimi i imunocitokimisë si një teknikë morfomolekulare. Cancer Cytopathol. 2016;124(8):540-545. doi:10.1002/cncy.21692

[2] Kanber Y, Pusztaszeri M, Auger M. Imunocitokimia për citopatologjinë diagnostikuese - Një udhëzues praktik. Citopatologjia. 2021;32(5):562-587. doi:10.1111/cyt.12993

[3] Jain D, Bubendorf L. Imunocitokimia në citologji: mit apo realitet. Acta Cytol. Botuar në internet më 30 janar 2025. doi:10.1159/000543867

[4] Happonen RP, Heikinheimo K. Hyrje në imunocitokimi. Proc Finn Dent Soc. 1989; 85 (2): 61-67.

[5] Skoog L, Tani E. Imunocitokimia: një teknikë e domosdoshme në citologjinë rutinë. Citopatologjia. 2011;22(4):215-229. doi:10.1111/j.1365-2303.2011.00887.x

[6] Burry RW. Kontrollet për imunocitokiminë: një përditësim. J Histochem Cytochem. 2011;59(1):6-12. doi:10.1369/jhc.2010.956920