Protokolli i Imunofluoreshencës (IF) dhe Pyetjet e Shpeshta

Imunofluoreshenca (IF) është një metodë eksperimentale që kombinon parimet imunologjike dhe teknikat e fluoreshencës. Përdoret gjerësisht në kërkimin biologjik, veçanërisht në biologjinë qelizore, biologjinë molekulare dhe patologjinë. Imunofluoreshenca zbulon dhe lokalizon shpërndarjen e proteinave specifike ose molekulave të tjera në qeliza ose inde duke lidhur antitrupa specifikë me antigjenin e synuar dhe nga antitrupa sekondarë të etiketuar me fluoreshencë ose antitrupa të etiketuar drejtpërdrejt.

Parimi i Imunofluoreshencës

Imunofluoreshenca përdor lidhjen midis antitrupave dhe antigjeneve të tyre specifike për të identifikuar molekulat e synuara. Antitrupi është shumë specifik për antigjenin e synuar dhe mund të lidhet me saktësi me proteinën e synuar ose molekulat e tjera. Antitrupat zakonisht bashkangjiten me etiketa fluoreshente (si FITC, Cy3, etj.). Këto ngjyrues fluoreshente mund të lëshojnë dritë të dukshme nën rrezatimin e dritës së ngacmimit. Përmes ngjyruesve të ndryshëm fluoreshente, molekula të shumëfishta të synuara mund të zbulohen në të njëjtën mostër. Mostrat u vëzhguan me mikroskop fluoreshent pas etiketimit me fluoreshencë. Mikroskopia e fluoreshencës mund të ngacmojë ngjyruesit fluoreshente në gjatësi vale specifike për të lëshuar fluoreshencë në gjatësi vale specifike, duke treguar kështu pozicionin e molekulës së synuar në qelizë ose ind.

Hapat e imunofluoreshencës

Përgatitja e mostrës

Përgatitja e mostrës është një hap shumë i rëndësishëm në eksperimentet e imunofluoreshencës. Qëllimi është të sigurohet që molekula e synuar të mbetet e qëndrueshme dhe antitrupi të mund të hyjë në mënyrë efektive në qelizë ose ind për etiketim. Qelizat ose seksionet e indeve fiksohen me fiksues (si formaldehidi, acidi acetik akullnajor ose etanoli) për të ruajtur integritetin e strukturës qelizore duke parandaluar degradimin e proteinës së synuar. Fiksuesi i përdorur zakonisht është 4% paraformaldehid (PFA), i cili mund të fiksohet në temperaturë ambienti dhe zakonisht zgjat 10-30 minuta. Për të lejuar antitrupin të depërtojë në membranën qelizore ose indin, surfaktantët (si Triton X-100, Saponin ose Tween-20) zakonisht përdoren për trajtim osmotik. Depërtuesi shkatërron integritetin e membranës qelizore, duke lejuar antitrupin të hyjë në qelizë. Për të zvogëluar lidhjen jo-specifike, qelizat ose seksionet e indeve bllokoheshin me tretësirë bllokuese (zakonisht një tampon që përmban BSA (albuminë serumi gjedhi) ose serum normal të kafshëve). Ky hap zakonisht zgjat 30 minuta deri në 1 orë.

Inkubacioni i Antitrupave

Hapi i inkubimit të antitrupave është një hap kyç në imunofluoreshencë, që përfshin lidhjen e antitrupave specifikë me antigjenet e synuara. Antitrupat primarë specifikë (domethënë antitrupat që lidhen me antigjenin e synuar) u shtuan dhe u lanë të lidhen me molekulën e synuar në mostër. Antitrupat primarë zakonisht inkubohen gjatë natës në 4℃ ose inkubohen në temperaturë ambienti për 1-2 orë. Inkubimi i antitrupave sekondarë (nëse përdoret imunofluoreshencë indirekte): Nëse përdoret imunofluoreshencë indirekte, pasi antitrupi primar lidhet me antigjenin e synuar, shtohet një antitrup sekondar i etiketuar me fluoreshencë. Antitrupat sekondarë janë antitrupa kundër antitrupave primarë, zakonisht të nxjerrë nga specie të ndryshme, të cilat mund të përforcojnë sinjalin.

Larje

Hapi i larjes është heqja e antitrupit që nuk është i lidhur me antigjenin dhe zvogëlimi i ndërhyrjes së sinjalit të sfondit. Lani mostrën disa herë me PBS (tretësirë fiziologjike e tamponuar me fosfat) ose TBS (tretësirë fiziologjike e tamponuar me Tris), zakonisht 5-10 minuta çdo herë, për të hequr antitrupat e palidhur dhe papastërtitë e tjera.

Ngjyrosje me fluoreshencë

Në këtë hap, molekula e synuar në qelizë ose ind do të tregohet nga antitrupa të etiketuar me fluoreshencë.

Nëse përdoret metoda e imunofluoreshencës indirekte, antitrupi sekondar do të etiketojë ngjyrën fluoreshente. Ngjyrat fluoreshente që përdoren zakonisht përfshijnë FITC (jeshile izotiocianati fluoreshente), Cy3 (e kuqe), ngjyrat e serisë Alexa Fluor, etj.

Vulë mostre

Për të lehtësuar vëzhgimin dhe për të parandaluar tharjen ose dëmtimin e mostrës nën mikroskop, zakonisht është e nevojshme të përdoret një lëng vulosës për të vulosur filmin. Mostra u vulos duke përdorur një tretësirë vulosëse që përmban një zbutës antifluoreshencë (siç është një tretësirë vulosëse që përmban DAPI). Tretësira vulosëse jo vetëm që mund ta mbrojë mostrën nga ndikimi i mjedisit të jashtëm, por edhe të përmirësojë sinjalin e fluoreshencës.

Vëzhgim me mikroskop fluoreshent

Së fundmi, mostrat u vëzhguan duke përdorur një mikroskop fluoreshent. Mikroskopi fluoreshent mund të ngacmojë ngjyrën fluoreshente në mostër dhe të zbulojë shpërndarjen e molekulës së synuar. Ngjyrat fluoreshente lëshojnë dritë të dukshme me një gjatësi vale specifike përmes një burimi drite ngacmuese (zakonisht dritë ultravjollcë ose dritë blu). Ngjyrat e ndryshme fluoreshente kanë gjatësi vale të ndryshme ngacmimi dhe emetimi, dhe objektiva të shumëfishta etiketimi mund të vëzhgohen përmes filtrave të ndryshëm.

1Përgatitja e mostrës: e fiksuar, infiltrimi, e mbyllur.
2 Inkubimi i antitrupave: u shtuan antitrupa primarë (ose antitrupa primarë dhe sekondarë).
3 Larja: Hiqni antitrupat e palidhur.
4 Ngjyrosje fluoreshente: ngjyrues fluoreshent i etiketuar.
5 Vulosja: përdorni lëngun vulosës për të vulosur filmin.
6 Vëzhgim me mikroskop fluoreshent: Vëzhgoni dhe regjistroni sinjalin e fluoreshencës.

Figura 1. Imunofluoreshencë direkte. (Burimi i referencës: Një hyrje në kryerjen e ngjyrosjes me imunofluoreshencë.)

Figura 2. Imunofluoreshencë indirekte. (Burimi i referencës: Një hyrje në kryerjen e ngjyrosjes me imunofluoreshencë.）

Figura 3. Amplifikimi i sinjalit me antitrupa sekondarë poliklonalë të etiketuar me një fluorofor. (Burimi i referencës: Një hyrje në kryerjen e ngjyrosjes me imunofluoreshencë.）

Figura 4. Amplifikimi i sinjalit nga një antitrup sekondar i konjuguar me komplekse të shumëfishta proteinash fluorofore. (Burimi i referencës: Një hyrje në kryerjen e ngjyrosjes me imunofluoreshencë.)

Figura 5. Amplifikimi i sinjalit me antitrupa sekondarë poliklonalë të konjuguar me komplekse të shumëfishta fluorofore-proteine. (Burimi i referencës: Një hyrje në kryerjen e ngjyrosjes me imunofluoreshencë.)

Avantazhet e imunofluoreshencës

Ndjeshmëri e lartë: Etiketimi me fluoreshencë ka ndjeshmëri të lartë dhe mund të zbulojë proteina ose molekula me shprehje të ulët.

Lokalizimi hapësinor: Mund të tregojë qartë vendndodhjen specifike dhe shpërndarjen e proteinës së synuar në qeliza ose inde.

Etiketim i shumëfishtë: proteina të shumëfishta të synuara mund të zbulohen njëkohësisht, dhe etiketimi i shumëfishtë mund të arrihet duke përdorur ngjyra fluoreshente me gjatësi vale të ndryshme.

Jo-invazive: Vëzhgimi i mostrave biologjike në një mënyrë jo-invazive nuk do të ndryshojë strukturën e mostrës.

Zbatimi i imunofluoreshencës

Lokalizimi i proteinave

Shpërndarja e proteinave të synuara në qeliza, të tilla si membrana qelizore, bërthama, citoplazma, etj., mund të lokalizohet me anë të imunofluoreshencës.

Analiza e qelizave dhe indeve

Imunofluoreshenca mund të përdoret për të analizuar shprehjen e proteinave specifike në qeliza dhe prerje të indeve.

Analiza e bashkë-lokalizimit

Bashkë-lokalizimi dhe bashkëveprimi i proteinave të ndryshme mund të vërehet nga etiketimet e shumëfishta dhe ngjyrat e ndryshme të ngjyrave fluoreshente.

Hulumtimi i Sëmundjeve

Imunofluoreshenca përdoret për të zbuluar shënjuesit patologjikë dhe proteinat anormale në kancer, sëmundje neurologjike, sëmundje imune dhe studime të tjera.

Alpha Lifetech ofron shërbime të imunofluoreshencës për të ndihmuar klientët të arrijnë analizë të saktë vizuale të molekulave të synuara, për të ndihmuar studiuesit të kuptojnë thellësisht proceset biologjike të qelizave dhe mekanizmat e sëmundjeve, dhe më pas të promovojnë zhvillimin e kërkimit biomjekësor dhe diagnozës klinike.

Pyetje të shpeshta

1. Në eksperimentin e imunofluoreshencës, sinjali i sfondit është i fortë, gjë që e bën të pamundur vëzhgimin e qartë të molekulës së synuar.

Zgjidhje: (1) Bllokim jo i plotë: Sigurohuni që të përdorni tretësirën e duhur bllokuese (si BSA, serum normal, etj.), dhe bllokoni për një kohë të mjaftueshme (30 minuta deri në 1 orë) për të parandaluar lidhjen jo-specifike. (2) Përqendrimi i antitrupave është shumë i lartë: zvogëloni përqendrimin e antitrupave primarë ose sekondarë për të shmangur lidhjen jo-specifike. Larje joadekuate: Rritni numrin dhe kohën e larjes për të siguruar heqjen e antitrupave të palidhur. (3) Përdorni antitrupa me cilësi të lartë: zgjidhni antitrupa me specifikë të fortë dhe afinitet të lartë për të zvogëluar mundësinë e lidhjes jo-specifike.
2. Sinjali i fluoreshencës është i dobët ose nuk mund të zbulohet, duke rezultuar në padukshmërinë e molekulës së synuar.

Zgjidhjet: (1) Përqendrimi i antitrupave është shumë i ulët: rritni përqendrimin e antitrupave primarë ose sekondarë për të siguruar që antitrupi të mund të lidhet plotësisht me antigjenin e synuar. (2) Cilësi e dobët e antitrupave të etiketuar me fluoreshencë: Zgjidhni antitrupa me cilësi të lartë të etiketuar me fluoreshencë për të siguruar intensitetin dhe stabilitetin e ngjyruesit. (3) Problemi i fiksimit të mostrës: Sigurohuni që hapat e fiksimit janë të mjaftueshëm për të shmangur degradimin ose ndryshimet konformacionale të molekulës së synuar gjatë procesit të fiksimit. (4) Dobësimi i fluoreshencës së ngjyrave fluoreshente: përdorimi i agjentit të dobësimit anti-fluoreshencë të tretësirës vulosëse, për të parandaluar dobësimin e sinjalit të fluoreshencës me kalimin e kohës.
3. Mostra mund të jetë e kontaminuar, duke rezultuar në rezultate eksperimentale të pasakta ose të pabesueshme.

Zgjidhjet: (1) Operacion i papastër: sigurohuni që të gjitha pajisjet dhe reagentët e përdorur në eksperiment të jenë të pastër dhe shmangni kontaminimin e kryqëzuar. (2) Përdorni reagentë të freskët: Zëvendësoni reagentët rregullisht për të shmangur rezultatet e paqëndrueshme të shkaktuara nga plakja ose përkeqësimi i reagentit. (3) Shmangni tharjen e mostrës: Mbajeni mostrën të lagësht gjatë operacionit për të parandaluar tharjen e mostrës para mikroskopisë fluoreshente.
4. Lidhja e antitrupit me antigjenin e synuar nuk është specifike, gjë që mund të çojë në pozitiv ose negativ të rremë.

Zgjidhjet: (1) Zgjidhni antitrupa me cilësi të lartë: Blini një antitrup të provuar dhe me cilësi të lartë ose krijoni një antitrup plotësisht të validuar. (2) Optimizimi i kushteve të inkubacionit të antitrupave: Rregulloni kohën e inkubacionit, përqendrimin dhe temperaturën e antitrupit për të siguruar efektin më të mirë të lidhjes. (3) Kontroll negativ: Specifikiteti i antitrupit verifikohet duke shtuar një kontroll negativ (p.sh., serum jo-imun ose antitrup i palidhur).
5. Pas hapit të fiksimit të qelizës ose indit, antitrupi nuk mund të hyjë në qelizë ose ind pa probleme.

(1) Trajtim osmotik i përshtatshëm: Trajtimi osmotik kryhet duke përdorur surfaktantë (si Triton X-100 ose Saponin) në mënyrë që antitrupi të mund të hyjë në qelizë. (2) Zgjidhni fiksuesin e duhur: Sigurohuni që fiksuesi të stabilizojë strukturën qelizore pa ndikuar në hyrjen e antitrupit.

referencë

[1] Im K, Mareninov S, Diaz MFP, Yong WH. Një hyrje në kryerjen e ngjyrosjes me imunofluoreshencë. Methods Mol Biol. 2019;1897:299-311. doi:10.1007/978-1-4939-8935-5_26

[2] Odell ID, Cook D. Teknikat e imunofluoreshencës. J Invest Dermatol. 2013;133(1):e4. doi:10.1038/jid.2012.455

[3] Aros CJ. Imunofluoreshenca indirekte e seksioneve të indeve. Metodat Mol Biol. 2022;2386:17-26. doi:10.1007/978-1-0716-1771-7_2

[4] Maecker HT, Maino VC, Picker LJ. Analiza e imunofluoreshencës së përgjigjeve të qelizave T në shëndet dhe sëmundje. J Clin Immunol. 2000;20(6):391-399. doi:10.1023/a:1026403724413