Protokolli i Imunohistokimisë (IHC) dhe Pyetjet e Shpeshta

Imunohistokimia (IHC) është një teknikë e përdorur gjerësisht në biologjinë qelizore dhe patologjinë. Ajo realizon lokalizimin dhe analizën sasiore të proteinave, antigjeneve ose shënjuesve molekularë specifikë duke përdorur lidhjen specifike midis antitrupave dhe antigjeneve të synuara dhe duke kombinuar analizën morfologjike në prerjet e indeve. IHC jo vetëm që mund të përdoret për të studiuar mekanizmin e sëmundjes, por gjithashtu luan një rol të rëndësishëm në diagnostikimin e kancerit, lokalizimin molekular të shënjuesve, kërkimin e funksionit të proteinave e kështu me radhë.

Parimi i Imunohistokimisë

Seksionet e indeve zakonisht fiksohen me reagentë kimikë si formalina gjatë procesit të fiksimit, gjë që mund të shkaktojë errësimin e epitopit të antigjenit. Prandaj, në eksperimentet IHC, së pari është e nevojshme të ekspozohen epitopet e antigjenit përmes riparimit të antigjenit (siç është riparimi i antigjenit i induktuar nga nxehtësia ose riparimi i induktuar nga enzima). Përmes këtij procesi, molekulat e ndërlidhura në procesin e imobilizimit mund të hiqen, struktura tre-dimensionale e antigjenit mund të rikthehet dhe lidhja e antitrupave mund të lehtësohet. Bërthama e eksperimentit imunohistokimik është reaksioni antigjen-antitrup. Duke aplikuar një antitrup primar specifik (antitrup primar), ai mund të lidhet me antigjenin e synuar në seksion për të formuar një kompleks antigjen-antitrup. Për të rritur sinjalin dhe për të përmirësuar ndjeshmërinë e zbulimit, në eksperimentet IHC u përdorën antitrupa sekondarë (antitrupa sekondarë). Antitrupi sekondar është një antitrup kundër një specieje të derivuar nga antitrupat primarë (siç janë antitrupat anti-miu të lepurit), dhe një shënues (siç është një enzimë ose një ngjyrues fluoreshent) zakonisht i bashkëngjitet antitrupit sekondar. Përmes kombinimit të antitrupave sekondarë dhe antitrupave primarë, shënuesit mund të ngjiten në kompleksin antigjen-antitrup për të amplifikuar sinjalin dhe për të lehtësuar zbulimin pasues. Shënuesit e përdorur zakonisht përfshijnë peroksidazën e rrikës (HRP) dhe fosfatazën alkaline (AP). Shënuesit në antitrupin sekondar gjenerojnë sinjale të dukshme përmes reaksioneve specifike. Nëse shënuesi është një enzimë, pasi antitrupi sekondar lidhet, enzima reagon me substratin përkatës për të formuar një precipitat ose një reaksion me ngjyra, duke vëzhguar kështu pozicionin e shënuesit nën mikroskop. Reaksioni i zakonshëm i substratit enzimatik është reaksioni DAB (3,3'-diaminobenzidinë), i cili mund të gjenerojë precipitat ngjyrë kafe dhe të tregojë qartë vendndodhjen e antigjenit. Në disa raste, shënuesi mund të jetë një ngjyrues fluoreshent, i cili më pas vërehet duke përdorur një mikroskop fluoreshent për të gjeneruar një sinjal fluoreshence në një gjatësi vale specifike. Në eksperimentet IHC, ngjyruesit bërthamorë si hematoksilina zakonisht përdoren si ngjyrosje kontrasti për të dalluar bërthamën nga citoplazma, në mënyrë që të lokalizohet më qartë vendndodhja e antigjenit.

Hapat e imunohistokimisë

Përgatitja e mostrës

Mostrat e indeve u morën, u fiksuan siç duhet (siç është fiksimi me formalinë) dhe më pas u futën në parafinë. Për të bërë prerje indesh, trashësia e zakonshme është 4-6 mikronë dhe prerjet duhet të vendosen në lamë. Deparafinizimi kryhet duke përdorur ksilen ose tretës të tjerë deparafine për të hequr dyllin e parafinës, dhe lahen gradualisht me etanol dhe në fund lahen me ujë të distiluar.

Riparimi i Antigjenit

Procesi i fiksimit mund të mbulojë epitopet e disa antigjeneve, kështu që kërkohet riparimi i antigjenit. Metodat e përdorura zakonisht përfshijnë riparimin e antigjenit të shkaktuar nga nxehtësia (HIER) dhe riparimin e shkaktuar nga enzimat. Metoda HIER është vendosja e prerjes në një tampon me temperaturë të lartë (siç është tamponi i acidit citrik) dhe aktivizimi i epitopit të antigjenit nga temperatura e lartë. Riparimi i shkaktuar nga enzimat (EIER) përdor enzima specifike për të hequr maskimin e antigjenit të shkaktuar nga proceset e lidhjes kryq ose të fiksimit në inde, duke rikthyer kështu epitopin e antigjenit dhe duke mundësuar që ai të njihet dhe të lidhet nga antitrupa specifikë. Kjo metodë është veçanërisht e përshtatshme për ato antigjene që nuk mund të rikthehen nga riparimi tradicional i antigjenit të shkaktuar nga nxehtësia (HIER), veçanërisht disa shënjues të sipërfaqes qelizore ose antigjene më të brishta.

Bllokimi i lidhjes jo-specifike

Seksionet u trajtuan me tretësirë bllokuese (si një tretësirë që përmban albuminë të serumit të gjedhit (BSA) ose serum normal të dhisë) për të shmangur lidhjen jo-specifike të antitrupave sekondarë.

Inkubimi i antitrupave primarë

Duke inkubuar antitrupin primar specifik me prerjen, antitrupi primar do të lidhet posaçërisht me antigjenin e synuar në prerje. Koha dhe temperatura e inkubacionit duhet të optimizohen sipas karakteristikave të antitrupit primar.

Inkubacioni Sekondar i Antitrupave

Pas inkubimit me antitrupin primar, antitrupi sekondar që korrespondon me speciet primare të antitrupave përdoret për inkubim, dhe antitrupi sekondar zakonisht kombinohet me shënuesin (siç është enzima ose ngjyruesi fluoreshent) për amplifikimin pasues të sinjalit.

Reagimi i Ngjyrës

Metodat e zakonshme të zhvillimit të ngjyrës përfshijnë lidhjen e HRP (peroksidazës së rrikës) me substratin për të formuar një produkt me ngjyrë, ose përdorimin e një antitrupi sekondar të etiketuar me fluoreshencë për mikroskopinë fluoreshente. Procesi i ngjyrosjes do të zmadhojë ngjyrosjen e pozicionit të antigjenit, në mënyrë që ai të mund të shihet.

Ngjyrosje me kontrast bërthamor

Hematoksilina zakonisht përdoret për ngjyrosjen bërthamore për të krahasuar vendndodhjen e antigjeneve dhe bërthamave nën mikroskop.

Vulosje

Pas ngjyrosjes, seksionet u vulosën me material izolues për vëzhgim mikroskopik. Zgjedhja e ngjitësit izolues duhet të sigurojë ruajtjen afatgjatë të rezultateve të ngjyrosjes.

Vëzhgim dhe Analizë Mikroskopike

Seksionet e indeve të përpunuara u vëzhguan me mikroskop për të analizuar vendndodhjen, shprehjen dhe shpërndarjen e antigjeneve. Sipas intensitetit të ngjyrosjes dhe morfologjisë së indeve, u kombinuan me analizë sasiore (siç është softueri i analizës së imazhit) për vlerësim të mëtejshëm.

Figura 1. Diagrama që tregon mekanizmin e secilës platformë mIHC/IF. (A) Sistemi DISCOVERY ULTRA: pas inkubacionit primar të antitrupave, futet një antitrup sekondar i etiketuar me HRP. HRP reagon me një substrat të përshtatshëm të lidhur me një ngjyrues kromogjenik, duke çuar në reshjen e precipitateve të patretshme, me ngjyra në vendin ku gjenden antigjenet. (B) Teknikat IHC të bazuara në metale si IMC dhe MIBI: një antitrup primar i lidhur me antigjenin e synuar etiketohet me një izotop metali me masë molekulare të njohur. Analiza kryhet duke përdorur spektrometrinë masive në MIBI dhe ablacionin me lazer të shoqëruar me citometrinë masive në IMC. (C) Vectra: pas inkubacionit primar të antitrupave, futet një antitrup sekondar i etiketuar me HRP. Një molekulë tiramide e konjuguar me fluorofor shërben si substrat për HRP, duke rezultuar në një sinjal fluoreshence të shoqëruar me antigjenin. (D) DSP e Nanostring: antigjeni i synuar do të lidhë antitrupin primar i cili është i çiftëzuar me një etiketë oligonukleotide fotocopëtueshme. Drita UV përdoret për të copëtuar etiketat e oligonukleotideve dhe mblidhet duke përdorur një tub mikrokapilar dhe ruhet në një pus mikropllake. Etiketat e oligonukleotideve do të lidhen me sondën raportuese nëpërmjet sondës së kapjes specifike për shënjestrën. Sondat raportuese imazherohen dhe numërohen nga sistemi i analizës nCounter. Shkurtimet: mIHC/IF, imunohistokimi/imunofluoreshencë multiplekse; HRP, peroksidazë rrikë e hirtë; IHC, imunohistokimi; IMC, Citometri Masore Imazherike; MIBI, Imazhe me Rreze Jonike të Multipleksuara; DSP, Profilim Hapësinor Dixhital. (Burimi i referencës: Përmbledhje e teknikave të imunohistokimisë multiplekse/imunofluoreshencës në epokën e imunoterapisë së kancerit.)

Avantazhet e imunohistokimisë

Specifikitet i lartë: Përmes specifikës së reaksionit antigjen-antitrup, molekula e synuar mund të pozicionohet me saktësi në nivelin e indeve.

Informacion morfologjik: IHC jo vetëm që ofron informacion në nivel molekular, por gjithashtu kombinon karakteristikat morfologjike të seksioneve histologjike për të ofruar analizë të lokalizimit në nivel indesh ose qelizash.

Zbulimi i shumëfishtë: ngjyrosja e shumëfishtë mund të kryhet duke përdorur antitrupa të ndryshëm dhe duke kombinuar shënjues të ndryshëm për të zbuluar shprehjen dhe lokalizimin e antigjeneve të shumëfishta.

Zbatimi i imunohistokimisë

Diagnoza e kancerit

IHC mund të ndihmojë në identifikimin e shënjuesve molekularë specifikë në qelizat kancerogjene për klasifikimin, stadifikimin dhe vlerësimin e prognozës së kancerit.

Hulumtime Patologjike

IHC përdoret në fushën e patologjisë për të analizuar lloje të ndryshme të indeve dhe qelizave për të vlerësuar karakteristikat dhe mekanizmat e sëmundjeve të caktuara.

Hulumtime Imunologjike

IHC mund të përdoret për të studiuar funksionin e sistemit imunitar dhe bashkëveprimin midis qelizave. Mund të ndihmojë në identifikimin e nëngrupeve specifike të qelizave imune, vlerësimin e përgjigjes imunitare dhe marrëdhënien e saj me sëmundjen.

Studim mbi Shënuesit e Sëmundjeve

Duke etiketuar antigjene specifike, IHC mund të ndihmojë në zbulimin e shënuesve të rinj të sëmundjeve. Për shembull, mund të përdoret për të studiuar përgjigjet inflamatore ose shënuesit molekularë të infeksioneve të caktuara bakteriale dhe virale.

Zhvillimi i Barnave dhe Provat Klinike

IHC përdoret për të vlerësuar efektet e barnave të reja në qeliza ose inde gjatë zhvillimit të barnave, veçanërisht duke vëzhguar ndryshimet në shprehjen e proteinave specifike. Përveç kësaj, përdoret edhe në provat klinike për të monitoruar përgjigjen e pacientëve ndaj barnave.

Alpha Lifetech siguron rezultate me cilësi të lartë dhe të riprodhueshme duke optimizuar me kujdes çdo analizë për antitrupat dhe llojet specifike të indeve të përdorura. Ata përmbushin një gamë të gjerë nevojash kërkimore, nga shkenca bazë te studimet translacionale dhe klinike. Angazhimi i Alpha Lifetech ndaj precizitetit dhe përsosmërisë i bën ata një partner të besuar për studiuesit që kërkojnë të përparojnë kuptimin e tyre të sistemeve biologjike dhe të përmirësojnë rezultatet e kujdesit shëndetësor.

Pyetje të shpeshta

1. Ngjyrosja jo-specifike ndodh shpesh në eksperimentet IHC, domethënë, antitrupat mund të lidhen me molekula të tjera përveç objektivit, duke rezultuar në ngjyrosje shumë të fortë të sfondit dhe duke ndikuar në interpretimin e rezultateve.

Zgjidhjet: (1) U përdorën grupe kontrolli të përshtatshme: duke përfshirë kontrolle negative (nuk u shtua antitrup primar ose sekondar) dhe kontrolle pozitive (inde të njohura që shprehin proteinën e synuar) për të konfirmuar specifikën e ngjyrosjes. (2) Optimizimi i përqendrimit të antitrupave: Ulja e përqendrimit të antitrupave ndonjëherë mund të zvogëlojë lidhjen jo-specifike. Rekomandohet të përdoret përqendrimi minimal efektiv. (3) Sfondi bllokues: Përdorimi i agjentëve bllokues të përshtatshëm (si serumi normal, BSA, etj.), rregullimi i përqendrimit të agjentit bllokues, bllokimi i vendeve të lidhjes jo-specifike në seksion. (4) Përmirësimi i hapave të larjes: Rritja e numrit të larjeve ose zgjatja e kohës për të hequr antitrupat e lidhur jo-specifikisht.
2. Proteina e synuar mund të mos zbulohet në eksperimentet IHC. Kjo mund të ndodhë për shkak se sinjali i ngjyrosjes është shumë i dobët ose nuk ka fare sinjal.

Zgjidhjet: (1) Kontrolloni efektivitetin e antitrupit: sigurohuni që lidhja e antitrupit me proteinën e synuar është efektive dhe përmbush kërkesat eksperimentale. Provoni antitrupa nga burime të ndryshme. (2) Zgjatja e kohës së inkubacionit të antitrupave: Zgjatja e përshtatshme e kohës së inkubacionit të antitrupave mund të përmirësojë sinjalin. (3) Optimizimi i përqendrimit të antitrupave: Ndonjëherë ulja e përqendrimit të antitrupave (veçanërisht antitrupi primar) ndihmon në uljen e lidhjes jo-specifike, duke rritur kështu intensitetin e sinjalit. (4) Optimizimi i hapit të riparimit të antigjenit: Nëse proteina e synuar është e fshehur në seksionin e indeve për shkak të procesit të fiksimit, përdorimi i një metode të përshtatshme të riparimit të antigjenit mund të ndihmojë në rivendosjen e zbulueshmërisë së saj.
3. Cilësia e dobët e prerjeve të indeve (si p.sh. shumë të holla, shumë të trasha, dëmtim i indeve etj.) mund të ndikojë në efektin e ngjyrosjes.

Zgjidhje: (1) Optimizimi i trashësisë së prerjes: Seksionet e indeve 4-6μm zakonisht rekomandohen për eksperimentet IHC. Seksionet shumë të holla mund të humbasin proteinën e synuar, ndërsa seksionet shumë të trasha mund të çojnë në ngjyrosje të pabarabartë. (2) Fiksimi i saktë i indeve: përdorni fiksuesin e duhur (siç është formalinë 10%) dhe sigurohuni që indi të jetë fiksuar plotësisht për të shmangur atrofinë ose deformimin e indeve. (3) Ruajtja e indeve: Sigurohuni që seksionet të ruhen siç duhet dhe të shmangni degradimin ose denatyrimin e antigjenit për shkak të ruajtjes së papërshtatshme.
4. Antitrupi mund të shkaktojë dështim të ngjyrosjes për shkak të afinitetit të pamjaftueshëm, reaksionit të kryqëzuar dhe arsyeve të tjera.

Zgjidhja: (1) Zgjidhni antitrupin e duhur: zgjidhni antitrupin që është verifikuar të jetë efektiv. Antitrupat komercialë me verifikim të mjaftueshëm mund të referohen ose të blihen. (2) Përdorimi i një antitrupi sekondar me cilësi më të lartë: Cilësia e antitrupit sekondar është shumë e rëndësishme për përmirësimin e sinjalit dhe kontrollin e ngjyrosjes së sfondit. Përdorni antitrupa sekondarë me afinitet të lartë dhe sfond të ulët. (3) Optimizimi i kushteve të inkubacionit: Sigurohuni që temperatura, koha dhe kushtet tampon të inkubacionit të antitrupave plotësojnë kërkesat e udhëzimeve të antitrupave.

referencë

[1] Hussaini HM, Seo B, Rich AM. Imunohistokimia dhe Imunofluoreshenca. Metodat Mol Biol. 2023;2588:439-450. doi:10.1007/978-1-0716-2780-8_26

[2] Ramos-Vara JA. Aspektet teknike të imunohistokimisë. Vet Pathol. 2005;42(4):405-426. doi:10.1354/vp.42-4-405

[3] Tan WCC, Nerurkar SN, Cai HY, etj. Përmbledhje e teknikave të imunohistokimisë multiplekse/imunofluoreshencës në epokën e imunoterapisë së kancerit. Cancer Commun (Lond). 2020;40(4):135-153. doi:10.1002/cac2.12023

[4] Moreno V, Smith EA, Piña-Oviedo S. Imunohistokimia Fluoreshente. Metodat Mol Biol. 2022;2422:131-146. doi:10.1007/978-1-0716-1948-3_9

[5] Ortiz Hidalgo C. Imunohistokimia në Perspektivën Historike: Njohja e së Kaluarës për të Kuptuar të Tashmen. Methods Mol Biol. 2022;2422:17-31. doi:10.1007/978-1-0716-1948-3_2