Protokolli i Imunoprecipitimit (IP) dhe Pyetjet e Shpeshta

Imunoprecipitimi (IP) është një teknikë eksperimentale e përdorur gjerësisht në studimet biologjike dhe biokimike. Ajo synon të pasurojë dhe ndajë proteinat e synuara ose komplekset e tyre nga përzierjet me anë të antitrupave specifikë. Teknologjia IP zakonisht përdoret për të studiuar ndërveprimin midis proteinave, shprehjes së proteinave dhe modifikimit të proteinave.

Parimi i imunoprecipitimit

Ideja thelbësore e imunoprecipitimit është përdorimi i lidhjes specifike të antitrupave me antigjenet e synuara. Në eksperiment, antitrupi së pari përzihet me një lizat qelizor që përmban proteinën e synuar ose mostra të tjera, dhe antitrupi do të lidhet me proteinën e synuar për të formuar një kompleks. Më pas, kompleksi antitrup-proteinë u nda nga tretësira duke shtuar sfera të përshtatshme të agarozës së proteinës A/G ose sfera magnetike. Kompleksi i ndarë mund të lahet për të hequr substancat jo-specifike të lidhjes, dhe së fundmi të zbulohet me anë të Western Blot dhe teknikave të tjera.

Hapat e imunoprecipitimit

Përgatitja e mostrës

Përgatitja e mostrës është hapi i parë i eksperimenteve të imunoprecipitimit. Sipas nevojave të eksperimentit, mostra mund të jetë lizat qelizor, ekstrakt indesh ose mjedis kulture. Gjatë procesit të përgatitjes, zakonisht përdoren tampona të përshtatshëm të lizës për të çliruar proteinat nga qelizat ose indet. Në këtë kohë, mostra përmban proteinën e synuar dhe proteina të mundshme jo të synuara, acide nukleike dhe përbërës të tjerë.

Lidhja e Antitrupave

Antitrupat specifikë iu shtuan mostrës. Antitrupat zakonisht synojnë epitope specifike të proteinës së synuar, kështu që ajo mund të lidhet në mënyrë efikase me proteinën e synuar. Antitrupi lidhet me proteinën e synuar për të formuar një kompleks antitrup-proteinë, i cili është çelësi i imunoprecipitimit. Zakonisht ka dy mundësi për llojin e antitrupit:

Antitrup monoklonal

Shumë specifik dhe i aftë të njohë epitope specifike të proteinës së synuar.

Antitrup poliklonal

Ai njeh epitope të shumta të proteinës së synuar dhe ka një gamë të gjerë njohjeje.

Kapja e komplekseve antitrup-proteinë

Për të ndarë kompleksin antitrup-proteinë shënjestër, sferat e agarozës së proteinës A/G ose sferat magnetike përdoren shpesh si bartës në eksperiment. Proteina A/G mund të lidhet me rajonin Fc të antitrupit, kështu që mund të lidhet me antitrupin duke u lidhur me antitrupin. Pas shtimit të antitrupave, komplekset antitrup-proteinë mund të kapen në dy mënyrat e mëposhtme:

Centrifugim

Kompleksi antitrup-proteinë ndahet nga mostra me anë të centrifugimit me shpejtësi të lartë. Grimcat (komplekset antitrup-proteinë) u precipituan në fund të epruvetës, ndërsa substancat e tjera të tretura u hoqën.

Ndarja magnetike

Kompleksi antitrup-proteinë u kap nga mostra duke përdorur sfera magnetike. Sferat magnetike ndahen nga përbërësi nga një fushë magnetike e jashtme.

Larje

Për të hequr papastërtitë e palidhura dhe molekulat jo të lidhura në mënyrë specifike, kërkohet larje. Tretësira larëse (tampon që përmban kripë) zakonisht përdoret për larje të shumëfishta. Ky proces ndihmon në heqjen e zhurmës në sfond dhe përmirësimin e specifikës së eksperimentit. Përbërja e tretësirës larëse mund të optimizohet sipas nevojës për të siguruar që papastërtitë e tepërta të hiqen pa ndikuar në kompleksin e proteinave të synuara.

Elucioni i Proteinës së Synuar

Pasi proteina e synuar të pasurohet me sukses, ndiqet hapi i elucionit për të ndarë proteinën e synuar nga kompleksi i antitrupave. Metodat e zakonshme të elucionit përfshijnë:

Elucioni konkurrues i antigjenit

Disociim konkurrues i komplekseve antitrup-proteinë duke përdorur antigjene të njëjta ose të ngjashme (zakonisht peptide të caktuara të proteinës së synuar) si proteina e synuar.

Ndryshimi i pH-it Elucion

Përdorni një tampon me pH të ulët ose të lartë për të ndërprerë lidhjen midis antitrupit dhe proteinës së synuar, duke eluuar kështu proteinën e synuar.

Pas eluimit, proteina e synuar mund të analizohet me anë të SDS-PAGE, Western Blot dhe teknikave të tjera.

Analiza dhe Zbulimi

Proteina e synuar pas elucionit mund t'i nënshtrohet një sërë analizash. Metodat e përdorura zakonisht përfshijnë:

SDS-FAQE

Proteina u nda me anë të elektroforezës sipas peshës molekulare, dhe u analizuan pastërtia dhe pesha molekulare e proteinës.

Western Blot

Përdoret për të zbuluar praninë dhe shprehjen e proteinave specifike, si dhe për të identifikuar proteinën e synuar nga antitrupat e etiketuar.

Spektrometria masive

Për identifikim dhe përcaktim sasior të mëtejshëm të proteinës së synuar.

Figura 1. Paraqitje skematike e fazave të protokollit të imunoprecipitimit të paraqitur në Protokollin Bazë 1. (1) Liza e qelizave: antigjenet treten me anë të nxjerrjes së qelizave në prani ose mungesë të detergjentëve. Për të rritur specifikën, lizat qelizor mund të pastrohet paraprakisht me sfera proteine A-agaroze (hapat 15 deri në 17, nuk tregohen). (2) Imobilizimi i antitrupave: një antitrup specifik lidhet me sferat proteine A-agaroze. (3) Kapja e antigjenit: antigjeni i tretur izolohet në sfera të konjuguara me antitrupa. (Burimi i referencës: Imunoprecipitimi. doi:10.1002/0471140864.ps0908s18）

Zbatimi i imunoprecipitimit

Studime të Ndërveprimit Proteinë-Proteinë

Me anë të imunoprecipitimit, mund të kapen proteina të tjera që bashkëveprojnë me proteinën e synuar.

Pasurimi dhe Analiza e Komplekseve të Proteinave

Përdoret për të analizuar përbërjen dhe funksionin e komplekseve të proteinave.

Zbulimi i Epitopeve Antigjenike

Teknologjia IP mund të identifikojë lidhjen e antitrupave me antigjene specifike.

Hulumtimi i Modifikimit të Proteinave

Për studimin e fosforilimit të proteinave, acetilimit dhe modifikimeve të tjera.

Alpha Lifetech ka shumë vite përvojë në projekte dhe mund t'u shërbejë më mirë nevojave të klientëve. Alpha Lifetech ofron shërbime imunoprecipitimi (IP) me specifikë dhe ndjeshmëri të lartë për të siguruar nxjerrjen dhe analizën efikase të proteinave të synuara nga mostra të ndryshme biologjike.

Pyetje të shpeshta

1. Në eksperimentet e imunoprecipitimit, nëse proteina e synuar është e kontaminuar nga proteina lidhëse jo-specifike, kjo do të çojë në sinjale të larta sfondi ose rezultate me specifikë të ulët. Sinjali i lartë i sfondit do të ndikojë në analizën e rezultateve eksperimentale dhe do të zvogëlojë zbulueshmërinë e proteinës së synuar.

Zgjidhjet: (1) Optimizoni përzgjedhjen e antitrupave: Zgjidhni antitrupa monoklonalë shumë specifikë ose antitrupa të validuar. Sigurohuni që antitrupi synon epitopin e vetëm të proteinës së synuar dhe shmangni reaksionin e kryqëzuar me proteinën jo-shënjestër. (2) Përdorni tampon larës të përshtatshëm: rritni numrin e hapave të larjes dhe përdorni tampon me përmbajtje të lartë kripe për të hequr molekulat lidhëse jo-specifike. Përbërja e tretësirës larëse duhet të optimizohet sipas karakteristikave të antitrupit dhe proteinës së synuar. (3) Përdorimi i agjentëve bllokues: Bllokuesit (si BSA ose albumina e serumit të gjedhit) mund të përdoren për të bllokuar vendet e mundshme të lidhjes jo-specifike para lidhjes së antitrupave për të zvogëluar sfondin.
2. Ndonjëherë eksperimenti nuk mund të marrë reshjet e pritura të proteinës së synuar, kjo mund të ndodhë sepse proteina e synuar nuk është kombinuar plotësisht me antitrupin, ose afiniteti i antitrupit është i ulët, duke rezultuar në pasurimin efektiv të proteinave të synuara.

Zgjidhjet: (1) Optimizimi i përqendrimit të antitrupave: sigurohuni që përqendrimi i antitrupave të përdorur është i përshtatshëm. Përqendrimi shumë i ulët i antitrupave mund të çojë në lidhje të pamjaftueshme, dhe përqendrimi shumë i lartë mund të çojë në lidhje jo-specifike. (2) Rritja e kohës dhe temperaturës së inkubacionit: Zgjatja e kohës së inkubacionit të antitrupit dhe mostrës, zakonisht inkubimi gjatë natës në 4°C, mund të përmirësojë efikasitetin e lidhjes. (3) Përdorimi i sferave bartëse të proteinave A/G të përshtatshme: Zgjidhni sferat bartëse të përshtatshme (si proteina A, proteina G, sferat magnetike) dhe sigurohuni që sferat të mund të lidhen në mënyrë efektive me antitrupin. (4) Optimizimi i lizës qelizore: Sigurohuni që të përdoret tamponi i duhur i lizës qelizore dhe optimizoni kushtet e lizës (si vlera e pH-it të tretësirës së lizës, përqendrimi i kripës, etj.) sipas vetive të proteinës së synuar.
3. Proteina e synuar mund të degradohet gjatë imunoprecipitimit, duke rezultuar në pamundësinë për të marrë rezultate efektive të precipitimit. Kjo zakonisht ndodh për shkak të pranisë së proteazave në mostër, ose kushtet e copëtimit nuk janë të përshtatshme për stabilizimin e proteinës.

Zgjidhjet: (1) Shtimi i frenuesve të proteazës: Frenuesit e proteazës (si PMSF, EDTA, përzierja e frenuesve të proteazës, etj.) u shtuan në lizat për të parandaluar degradimin e proteinave. (2) Optimizimi i kushteve të lizës: përdorni tampon të përshtatshëm të lizës për të shmangur prishjen e tepërt të qelizave ose dëmtimin e strukturës së proteinës së synuar. (3) Funksionimi në temperaturë të ulët: Përpiquni të ruani funksionimin në temperaturë të ulët në të gjitha hapat për të zvogëluar rrezikun e degradimit të proteinave.
4. Proteina e synuar e precipituar është e paplotë dhe disa proteina të synuara mund të mbeten në supernatant, duke rezultuar në një numër të vogël të proteinave të synuara të rikuperuara.

Zgjidhjet: (1) Optimizoni shpejtësinë dhe kohën e centrifugimit: sigurohuni që kushtet e centrifugimit të mund ta precipitojnë plotësisht kompleksin antitrup-proteinë. Për grimca më të vogla, mund të jetë e nevojshme të rritet koha e centrifugimit ose të rritet shpejtësia e centrifugimit. (2) Përdorimi i sferave magnetike: Përdorimi i sferave magnetike mund të kapë komplekset antitrup-proteinë në mënyrë më efikase dhe të zvogëlojë humbjet. (3) Rritja e proporcionit të sferave antitrup dhe bartës: rritja e përshtatshme e sasisë së antitrupave dhe sferave bartës për të përmirësuar efikasitetin e kapjes.
5. Në rezultatet e imunoprecipitimit, mund të ketë një numër të madh papastërtish të proteinave jo-objektive, duke rezultuar në pastërtinë e proteinës së synuar jo të lartë, duke ndikuar në analizën pasuese (siç është Western Blot).

Zgjidhje: (1) Larje të shumëfishta: Përdorni tampon larës të përshtatshëm dhe kryeni larje të shumëfishta për të hequr proteinat e lidhura jo-specifikisht. Përqendrimi i kripës së tretësirës larëse mund të rritet në mënyrë të përshtatshme për të ndihmuar në heqjen e disa molekulave të lidhura jo-specifikisht. (2) Përdoren skema të ndryshme larjeje: ndonjëherë sipas natyrës së proteinës së synuar, përbërja e tamponit larës mund të ndryshohet, siç është rritja e përqendrimit të detergjentit (si Triton X-100) për të ndihmuar në heqjen e proteinave të membranës ose proteinave të tjera të padëshiruara. (3) Zgjidhni antitrupat dhe sferat bartëse të përshtatshme: Përdorni antitrupa dhe sfera bartëse që janë të përshtatshme për proteinën e synuar për të siguruar që ato kanë një afinitet të lartë për proteinën e synuar dhe për të zvogëluar ndërhyrjen e papastërtive.

referencë

[1] DeCaprio J, Kohl TO. Imunoprecipitimi. Cold Spring Harb Protoc. 2017;2017(12):pdb.prot098640. Botuar më 1 dhjetor 2017. doi:10.1101/pdb.prot098640

[2] Bonifacino JS, Dell'Angelica EC, Springer TA. Imunoprecipitimi. Curr Protoc Protein Sci. 2001; Kapitulli 9:. doi:10.1002/0471140864.ps0908s18

[3] Wang L, Sanchez J, Hess D, Matthias P. Imunoprecipitimi i HDAC6 dhe proteinave bashkëvepruese. Methods Mol Biol. 2023;2589:493-508. doi:10.1007/978-1-0716-2788-4_32

[4] Mohammed H, Taylor C, Brown GD, Papachristou EK, Carroll JS, D'Santos CS. Spektrometria masive me imunoprecipitim të shpejtë të proteinave endogjene (RIME) për analizën e komplekseve të kromatinës. Nat Protoc. 2016;11(2):316-326. doi:10.1038/nprot.2016.020

[5] Sanz LA, Chédin F. Hartëzim i lakut R me rezolucion të lartë, specifik për fijet nëpërmjet imunoprecipitimit të ADN-ARN bazuar në S9.6 dhe sekuencimit me rendiment të lartë. Nat Protoc. 2019;14(6):1734-1755. doi:10.1038/s41596-019-0159-1