Protokolli i Prodhimit të Proteinave të Membranës dhe Pyetjet e Shpeshta

Proteinat e membranës janë një klasë proteinash të rëndësishme që ekzistojnë në membranën qelizore, intimën ose membranën plazmatike. Ato luajnë një rol kyç në funksionin qelizor, transduksionin e sinjalit, transportin e materialeve, njohjen e qelizave, shndërrimin e energjisë e kështu me radhë. Për shkak të strukturës dhe funksionit të veçantë të proteinave të membranës, kërkimi mbi prodhimin dhe funksionin e tyre ka qenë gjithmonë një pikë e nxehtë kërkimore në shumë fusha të tilla si biologjia, farmakologjia, biologjia strukturore dhe bioteknologjia.

Parimi i Prodhimit të Proteinave të Membranës

Parimi i prodhimit të proteinave të membranës përfshin disa hapa kyç, duke përfshirë shprehjen e proteinave të membranës, palosjen, futjen në membranë dhe mënyrën e nxjerrjes dhe pastrimit nga membrana. Parimi bazë është si më poshtë:

Përzgjedhja e Sistemeve të Shprehjeve

Për shkak të hidrofobicitetit të proteinave të membranës, ato nuk janë të lehta për t'u shprehur në mënyrë të qëndrueshme në një mjedis ujor. Prandaj, përzgjedhja e një sistemi të përshtatshëm shprehjeje është thelbësore për prodhimin e proteinave të membranës. Sistemet e shprehjes që përdoren zakonisht përfshijnë bakteret (si E.coli), maja, qelizat e insekteve dhe qelizat e gjitarëve. Çdo sistem ka avantazhet dhe disavantazhet e tij, dhe zgjedhja e sistemit zakonisht varet nga vetitë e proteinave të membranës dhe zbatimet e tyre.

Futja dhe palosja e proteinave të membranës

Proteinat e membranës zakonisht hyjnë në membranë përmes retikulumit endoplazmatik ose kanaleve të sintezës së proteinave të membranës. Në këtë proces, aftësia e proteinës për t'u palosur dhe për t'u futur në membranë është thelbësore. Disa proteina të membranës kërkojnë ndihmën e kofaktorëve specifikë ose proteinave chaperone për të përfunduar palosjen dhe funksionin e duhur.

Nxjerrja dhe Pastrimi

Proteinat e membranës zakonisht stabilizohen në membranën qelizore duke bashkëvepruar me shtresën e dyfishtë fosfolipide. Nxjerrja e proteinave të membranës kërkon përdorimin e surfaktantëve (siç është Dodecil β-D-maltozidi, Triton X-100, etj.) për të thyer membranën qelizore dhe për të çliruar proteinat e membranës. Roli i këtyre surfaktantëve është të shkatërrojnë strukturën e membranës duke ruajtur funksionin dhe strukturën e proteinës së membranës.

Shpërbërja dhe Stabiliteti Kompleks

Rajoni hidrofobik i proteinës së membranës e bën të lehtë grumbullimin ose precipitimin e saj në tretësira të tretshme në ujë, kështu që nevojiten tampona të përshtatshëm të tretjes dhe stabilizues ndihmës për të ruajtur stabilitetin e strukturës së saj.

Hapat e Prodhimit të Proteinës së Membranës

Procesi i prodhimit të proteinave të membranës përfshin hapa të shumtë: klonimin e gjenit, shprehjen, nxjerrjen, pastrimin dhe zbulimin funksional.

Klonimi i gjeneve

Prodhimi i proteinave të membranës zakonisht fillon me ndërtimin e vektorëve të shprehjes. Së pari, duhet të merren gjenet e proteinave të membranës së synuar. Ato mund të merren direkt me anë të amplifikimit PCR ose sintezës së gjeneve. Gjeni i synuar futet në një vektor të përshtatshëm shprehjeje me anë të teknologjisë së klonimit molekular, i cili zakonisht përmban gjene shënjuese alternative, siç janë gjenet e rezistencës ndaj antibiotikëve. Gjeni i synuar u klonua në sistemin e shprehjes me anë të copëtimit, lidhjes dhe transformimit nga enzimat e kufizimit.

Përzgjedhja dhe Transformimi i Sistemit të Shprehjeve

Sistemet e zakonshme të shprehjes së proteinave të membranës përfshijnë:

1Sistemi E.coli: Duke futur gjenin rekombinant në plazmidin e E.coli, ai shprehet në sasi të mëdha në kushte induksioni (si induksioni IPTG). E.coli ka avantazhet e kostos së ulët dhe efikasitetit të lartë të prodhimit. Megjithatë, për shkak të karakteristikave të proteinave të membranës, shumë proteina të membranës nuk mund të palosen dhe futen saktë në membranë në E.coli.
2Sistemi i majasë: Sistemi i majasë mund të paloset dhe të futet në membranë më saktë sesa E.coli, dhe është i përshtatshëm për disa proteina të membranës që kërkojnë glikozilim.
3 Sistemi qelizor i insekteve: Qelizat e insekteve mund t'i palosin më mirë proteinat e membranës dhe të marrin modifikime të përshtatshme duke shprehur vektorë viralë (siç është Bakulovirusi). Sistemet qelizore të insekteve janë të përshtatshme për disa nga proteinat më komplekse të membranës.
4 Sistemi qelizor i gjitarëve: Sistemi qelizor i gjitarëve mund të sigurojë glikozilim të plotë dhe palosje të saktë të proteinave të membranës, e cila është e përshtatshme për disa proteina të membranës me kërkesa të larta për glikozilim ose toksicitet.

Kultura dhe Shprehja e Induktuar

Pas përzgjedhjes së sistemit të duhur të shprehjes, qelizat e transformuara u rritën në mjedisin e duhur. Gjatë procesit të kultivimit, varësisht nga sistemi i zgjedhur, zakonisht kërkohet rregullimi i temperaturës ose shtimi i induktorit (siç është IPTG) për të nxitur shprehjen e proteinave të membranës. Shprehja e shumicës së proteinave të membranës duhet të kryhet në temperatura të ulëta për të shmangur reshjet e parakohshme të proteinave dhe palosjen e gabuar.

Nxjerrja dhe Tretja e Proteinave të Membranës

Proteinat e membranës në përgjithësi ekzistojnë në formën e membranave të ngulitura, të cilat duhet të çlirohen duke i thyer qelizat. Ekzistojnë shumë metoda të shkatërrimit të qelizave. Metodat e zakonshme përfshijnë:

1Ndërprerje tejzanor: Muri qelizor thyhet nga ultratingulli për të liruar proteinat e membranës.
2Homogjenizim me presion të lartë: këputja e qelizave nga presioni i lartë.
3 Metoda kimike: Përdorni reagentë kimikë, siç është lizozima, për të tretur membranat qelizore.

Pastaj, u shtuan surfaktantë të përshtatshëm (si Dodecil β-D-maltozidi, Triton X-100, etj.) për të ndihmuar në çlirimin e proteinave të membranës nga membrana dhe për të ruajtur tretshmërinë e tyre.

Pastrimi i Proteinës së Membranës

Pastrimi i proteinave të membranës zakonisht përdor kromatografinë e afinitetit, kromatografinë e shkëmbimit jonik, kromatografinë e filtrimit në xhel dhe teknika të tjera. Kromatografia e afinitetit zakonisht përdor etiketa (të tilla si etiketat 6xHis) ose pastrim specifik të antitrupave të proteinave të membranës. Filtrimi në xhel përdoret për të ndarë proteinat e membranës dhe papastërtitë e tjera të vogla molekulare sipas madhësisë molekulare. Gjatë procesit të pastrimit, është e rëndësishme të ruhet stabiliteti i proteinave të membranës. Stabilizuesit dhe kushtet e temperaturës së ulët shpesh kërkohen për të parandaluar degradimin ose grumbullimin e proteinave të membranës.

Zbulimi Funksional i Proteinave të Membranës

Proteina e pastruar e membranës ka nevojë për verifikim funksional. Metodat e testimit funksional të përdorura zakonisht përfshijnë:

1Analiza e lidhjes së receptorit: zbulon nëse proteinat e membranës mund të lidhen me ligandët e tyre të synuar ose me molekula të tjera.
2Përcaktimi i aktivitetit të kanalit jonik: Nëse proteina e membranës është një kanal jonik, ndryshimi i rrymës zbulohet me metodën elektrofiziologjike.
3 Analiza e spektrometrisë masive: verifikon më tej strukturën dhe glikozilimin e proteinave të membranës.

Figura 1. Konsiderata themelore të rëndësishme për hartimin fillestar të proceseve të shprehjes së CF. (Burimi i referencës: Prodhimi i proteinave të membranës në lizatet pa qeliza të Escherichia coli.)

Figura 2. Krahasim skematik i strategjive qelizore të shqyrtimit kundrejt atyre të CF për prodhimin e proteinave të membranës. (Burimi i referencës: Prodhimi i proteinave të membranës në lizatet pa qeliza të Escherichia coli.)

Zbatimi i Prodhimit të Proteinave të Membranës

Hulumtime mbi objektivat e barnave

Proteinat e membranës luajnë një rol të rëndësishëm në transduksionin e sinjalit qelizor, lidhjen dhe transportin e receptorëve, dhe kështu bëhen një objektiv i rëndësishëm për zhvillimin e barnave. Studimi i proteinave të membranës është i dobishëm për zhvillimin e barnave të reja të synuara, veçanërisht në fushat e kancerit, infeksioneve, sëmundjeve kardiovaskulare etj.

Zhvillimi i vaksinës

Disa proteina membranore (siç janë proteinat sipërfaqësore të patogjenëve) mund të përdoren si antigjene kandidate për vaksina. Për shembull, proteina membranore e virusit të influencës është një nga objektivat kryesorë për zhvillimin e vaksinave.

Hulumtime të Biologjisë Strukturore

Informacioni tre-dimensional i strukturës së proteinave të membranës është kritik për të kuptuar funksionet e tyre. Nëpërmjet kristalografisë me rreze X, mikroskopisë krio-elektronike (Cryo-EM) dhe teknikave të rezonancës magnetike bërthamore (NMR), marrëdhënia midis strukturës dhe funksionit të proteinave të membranës mund të eksplorohet më tej.

Biosensorë

Proteinat e membranës, veçanërisht kanalet jonike dhe proteinat e membranës të ngjashme me receptorët, mund të përdoren për të zhvilluar biosensorë. Këta sensorë mund të përdoren për monitorimin e mjedisit, zbulimin e patogjenëve, etj.

Alpha Lifetech ofron shërbime testimi të prodhimit të proteinave membranore të dizajnuara për të ofruar zgjidhje eksperimentale me cilësi të lartë për kërkimin në shkencat e jetës. Proteinat membranore luajnë një rol jetësor në funksionin qelizor, prandaj është veçanërisht e rëndësishme që ato të analizohen dhe prodhohen me saktësi. Ne përdorim platformë të teknologjisë së përparuar për të realizuar të gjithë shërbimin e procesit, nga përgatitja laboratorike në shkallë të vogël deri te prodhimi në shkallë të gjerë, dhe mund ta përshtasim planin e prodhimit sipas nevojave të klientit.

Pyetje të shpeshta

1. Shprehja e proteinave të membranës është zakonisht shumë më e ulët se ajo e proteinave të tretshme.

Shkaku: Kjo mund të jetë për shkak të hidrofobicitetit të proteinës së membranës, mekanizmit të saj të futjes dhe palosjes në membranën qelizore dhe kërkesave për sistemin e shprehjes, gjë që e bën efikasitetin e saj të prodhimit të ulët. Zgjidhje: (1) Optimizimi i sistemit të shprehjes: Përzgjedhja e sistemit të duhur të shprehjes është thelbësore për përmirësimin e shprehjes së proteinave të membranës. Sistemet e zakonshme të shprehjes përfshijnë Escherichia coli, maja, qelizat e insekteve dhe qelizat e gjitarëve. Për disa proteina, sistemet e qelizave të majasë dhe insekteve mund të jenë më efektive se E.coli. (2) Optimizimi i kushteve të kulturës: Kushtet e shprehjes u optimizuan duke rregulluar temperaturën, kohën e induksionit dhe përbërjen e mediumit. Për shembull, temperaturat më të ulëta mund të ngadalësojnë palosjen e gabuar dhe grumbullimin e proteinave të membranës në E.coli.
2. Proteinat e membranës zakonisht duhet të palosen saktë për të kryer funksione biologjike, por ato mund të mos palosen saktë gjatë shprehjes, duke rezultuar në humbje të funksionit ose reshje të agregimit.

Zgjidhjet: (1) Përdorimi i mjeteve ndihmëse: u përdorën shaperone për të ndihmuar palosjen e proteinave të membranës, ose promotorë të palosjes, siç janë surfaktantët jojonikë (siç është Dodecil β-D-maltozidi, Triton X-100, etj.) u shtuan për të nxitur palosjen e saktë të proteinave të membranës. (2) Kultura në temperaturë të ulët: rregullimi i temperaturës për të ngadalësuar shprehjen e proteinave të membranës dhe për të zvogëluar problemet e palosjes së gabuar dhe grumbullimit të shkaktuara nga mbishprehja. (3) Përdorimi i proteinave të ndryshme të bashkimit të proteinave të membranës: proteinat e bashkimit (siç është proteina fluoreshente jeshile (GFP) ose etiketat e afinitetit) që janë të përshtatshme për palosje mund të shtohen në N-terminusin ose C-terminusin e proteinës së membranës për të ndihmuar proteinën e membranës të paloset saktë.
3. Proteinat e membranës mund të jenë të paqëndrueshme gjatë nxjerrjes dhe pastrimit, të lehta për t'u degraduar ose grumbulluar, duke rezultuar në rendiment të ulët dhe vështirësi në marrjen e një numri të mjaftueshëm të produkteve të pastra.

Tretësira: (1) Përdorimi i stabilizuesve: Stabilizuesit (si gliceroli, glukoza, Ca2+, etj.) u shtuan gjatë nxjerrjes dhe pastrimit të proteinave të membranës për të ndihmuar në ruajtjen e stabilitetit të tyre strukturor. (2) Përdorimi i surfaktantëve: Përdorimi i përqendrimeve të përshtatshme të surfaktantëve (si Dodecil β-D-maltozidi, Triton X-100) mund të ndihmojë proteinat e membranës të mbeten të qëndrueshme në tretësirë dhe të parandalojnë grumbullimin e tyre. (3) Krio-konservimi: Proteinat e membranës duhet të ruhen në temperatura të ulëta për të shmangur degradimin ose humbjen e aktivitetit në temperatura të larta. Proteina e pastruar e membranës mund të ngrihet në −80 °C dhe të shmangë ngrirjen dhe shkrirjen e përsëritur.
4. Proteinat e membranës janë të ngulitura në membranën qelizore dhe zakonisht nuk nxirren lehtë nga membrana qelizore. Edhe duke përdorur metodat e zakonshme të thyerjes së membranës, nxjerrja e proteinave të membranës mund të jetë ende joefikase.

Tretësira: (1) Përdorimi i surfaktantëve të përshtatshëm: Nxjerrja e proteinave të membranës zakonisht mbështetet në surfaktantë për të shkatërruar membranat qelizore dhe për të tretur proteinat e membranës. Surfaktantët e përdorur zakonisht përfshijnë Triton X-100, Dodecil maltoside, n-dodecil-β-D-maltoside etj. Kur zgjidhni surfaktantë, është e nevojshme të balanconi aftësinë e tyre për të nxjerrë në mënyrë efektive proteinat e membranës, duke shmangur dëmtimin e strukturës dhe funksionit të proteinave. (2) Ultrasonizim ose homogjenizim me presion të lartë: Muri qelizor u thye me metoda fizike (si ultrasonizim ose homogjenizim me presion të lartë) për të nxjerrë proteinat e membranës intraqelizore. (3) Optimizimi i kushteve të thyerjes së membranës: rregulloni përqendrimin e surfaktantit, kohën dhe temperaturën e thyerjes së membranës, etj., për të siguruar që proteina e membranës të mund të lirohet në mënyrë efektive në tretësirë.

referencë

[1] Schavemaker PE, Poolman B. (Membrane) Prodhimi i proteinave në kontekst. Trendet Biochem Sci. 2018; 43 (11): 858-868. doi:10.1016/j.tibs.2018.08.009

[2] Vaitsopoulou A, Depping P, Bill RM, Goddard AD, Rothnie AJ. Prodhimi i Proteinave të Membranës në Qelizat e Insekteve. Methods Mol Biol. 2022;2507:223-240. doi:10.1007/978-1-0716-2368-8_12

[3] McIlwain BC, Kermani AA. Prodhimi i proteinave të membranës në Escherichia coli. Metodat Mol Biol. 2020; 2127: 13-2 doi: 10.1007/978-1-0716-0373-4_2

[4] Henrich E, Hein C, Dötsch V, Bernhard F. Prodhimi i proteinave membranore në lizatet pa qeliza të Escherichia coli. FEBS Lett. 2015;589(15):1713-1722. doi:10.1016/j.febslet.2015.04.045