Leave Your Message
rrëshqitje 1

Protokolli i Prodhimit të Nanobody dhe Pyetjet e Shpeshta

Mësoni rreth protokollit të Prodhimit të Nanobody, metodave dhe pyetjeve të shpeshta

NA KONTAKTONI
01

Protokolli i Prodhimit të Nanobody dhe Pyetjet e Shpeshta

Nano-trupi është një fragment që lidhet me antigjenin i një antitrupi me zinxhir të rëndë me një domen të vetëm (HCAb) të prodhuar natyrshëm nga kamelidët (si alpakat dhe devetë), i cili përmban vetëm një rajon të ndryshueshëm (VHH). Ndryshe nga antitrupat tradicionalë IgG (duke përfshirë zinxhirin e lehtë dhe zinxhirin e rëndë), nano-trupat kanë peshë të vogël molekulare (rreth 15 kDa), strukturë të thjeshtë, stabilitet të lartë dhe mund të ruajnë aktivitetin e lidhjes në kushte acidike, të temperaturës së lartë ose të përqendrimit të lartë të denaturantëve. Për shkak të vetive të tyre unike fizike dhe kimike, nano-trupat kanë treguar potencial të madh në kërkimin bazë, zhvillimin e reagentëve diagnostikues dhe bioterapinë.

Parimi i Prodhimit të Nano-Trupave (VHH)

Sistemi imunitar i kamelideve prodhon dy lloje antitrupash në përgjigje të patogjenëve: njëri është IgG tradicional (i përbërë nga dy zinxhirë të rëndë dhe dy zinxhirë të lehtë), dhe tjetri është një antitrup me një domen të vetëm (HCAb) i përbërë vetëm nga zinxhirë të rëndë. Ky lloj antitrupi është plotësisht i pavarur nga zinxhiri i lehtë, dhe funksioni i tij i lidhjes së antigjenit plotësohet plotësisht nga domeni variabël i zinxhirit të rëndë (VHH). Ky domen VHH është burimi i nanotrupave. Kur kamelidët imunizohen me antigjene, qelizat B që shprehin VHH specifike pasurohen në limfocitet e tyre periferike të gjakut. ARNi i këtyre qelizave u nxor dhe fragmenti i gjenit VHH u amplifikua me anë të PCR me transkriptim të kundërt. Më pas, gjeni VHH u fut në gjenin e proteinës së mbulesës së fagut me anë të teknologjisë së bibliotekës së shfaqjes së fagut, në mënyrë që fragmenti VHH të shfaqej në sipërfaqen e fagut. Duke përdorur shqyrtimin e imobilizimit të antigjenit (siç është ELISA) ose renditjen me citometri rrjedhëse, sekuencat VHH që lidhen posaçërisht me antigjenet mund të shqyrtohen në mënyrë efikase.

Avantazhet e Strukturës së Antitrupave me Domen të Vetëm

Krahasuar me rajonin variabël (domeni i dyfishtë VH + VL) të antitrupave tradicionalë, VHH mund të arrijë lidhjen e antigjenit vetëm duke u mbështetur në një domen të vetëm. Rajonet e tij përcaktuese ndërmolekulare plotësuese (CDR) janë të gjata, veçanërisht CDR3 shpesh formon një strukturë konvekse gishtore, e cila mund të depërtojë në xhepin hidrofobik ose epitopet komplekse në sipërfaqen e antigjenit. Përveç kësaj, rajonet kornizë të disa VHH përmbajnë mutacione aminoacidesh hidrofile, të cilat zvogëlojnë adsorbimin jo-specifik dhe përmirësojnë tretshmërinë.

Optimizimi dhe shprehja e inxhinierisë gjenetike

VHH-të e shqyrtuara natyrshëm duhet të optimizohen më tej për afinitet ose stabilitet me anë të mutaogjenezës së drejtuar në vend ose evolucionit in vitro (siç është PCR e prirur ndaj gabimeve). Gjeni përfundimtar i optimizuar u prodhua nga E.coli, maja dhe sisteme të tjera shprehjeje. Meqenëse nano-trupat janë të pavarur nga disulfidet, rezistentë ndaj temperaturave të larta dhe pH ekstrem, kostot e tyre të prodhimit dhe pastrimit janë dukshëm më të ulëta se antitrupat tradicionalë.

Hapat e Prodhimit të Nano-trupave

Procesi i prodhimit të nanotrupave përfshin kryesisht disa hapa kyç, siç janë imunizimi, ndërtimi i bibliotekës, shqyrtimi dhe shprehja.

Kafshë të vaksinuara

Hapi i parë në prodhimin e nanotrupave është aktivizimi i sistemit imunitar të kamelideve nëpërmjet një përgjigjeje imune. Zakonisht, antigjenet (të cilat mund të jenë proteina, peptide ose molekula të tjera) injektohen te kafshët. Sistemi imunitar i kafshës e njeh antigjenin dhe prodhon një përgjigje me antitrupa kundër antigjenit. Kafshët e racës Camelidae janë veçanërisht të përshtatshme për prodhimin e nanotrupave sepse ato mund të prodhojnë antitrupa të vegjël me specifikë të fortë dhe afinitet të lartë.

Mbledhja e mostrave imune

Kafshët pas imunizimit do të prodhojnë një numër të madh antitrupash. Më pas, studiuesit mund të mbledhin gjene të antitrupave që lidhen me antigjenet nga gjaku i kafshëve ose direkt nga qelizat e tyre B. Meqenëse nano-trupi përbëhet nga një rajon variabil i zinxhirit të rëndë (VHH), nxjerrja e gjeneve të zinxhirit të rëndë është thelbësore në këtë fazë.

Ndërtimi i Bibliotekës së Antitrupave

Duke izoluar dhe klonuar gjenet e zinxhirit të rëndë të qelizave B, studiuesit mund të ndërtojnë një bibliotekë të larmishme gjenesh të antitrupave. Kjo bibliotekë përmban një numër të madh gjenesh të antitrupave të zinxhirit të rëndë që mund të lidhen me antigjenet, dhe këto gjene do të transferohen në sistemin e shprehjes për shqyrtim dhe pasurim.

Shqyrtimi dhe Pasurimi

Përmes teknologjive të tilla si shfaqja e fagut dhe shfaqja e majasë, studiuesit mund të shqyrtojnë antitrupat në bibliotekë dhe të zgjedhin ato nanotrupa që mund të lidhen posaçërisht me antigjenin e synuar. Këto metoda shqyrtimi zakonisht bazohen në forcën lidhëse midis antigjenit dhe antitrupit për të shqyrtuar nanotrupat me afinitet më të lartë.

Shprehje dhe Pastrim

Pas shqyrtimit të nano-trupit ideal, studiuesit transferuan gjenin e tij në qelizat E.coli, maja ose gjitarë për shprehje. Nano-trupat e synuar u nxorën dhe u pastruan duke kultivuar sistemin e shprehjes dhe duke përdorur kromatografinë e afinitetit. Ky proces mund të prodhojë në mënyrë efektive një numër të madh nano-trupash me pastërti të lartë.

Aplikacioni

Nano-trupat e pastruar përdoren gjerësisht në mjekësi, diagnozë, trajtim dhe fusha të tjera. Për shkak të karakteristikave të tyre të vogla molekulare, nano-trupat mund të depërtojnë në inde, kanë biokompatibilitet më të mirë, imunogjenitet të ulët dhe stabilitet të fortë. Prandaj, nano-trupat kanë treguar përparësi të konsiderueshme në terapinë e synuar, diagnostikimin e sëmundjeve dhe zhvillimin e vaksinave.
prodhimi i nanobodieve
Figura 1. Paraqitje skematike e metodës konvencionale të gjenerimit të Nb-ve specifike për antigjenin duke përdorur një bibliotekë të shfaqjes së fagut. (Burimi i referencës: NANOBODIES®: Një përmbledhje e zbatimeve diagnostikuese dhe terapeutike.)
Alpha Lifetech ka bërë hapa të rëndësishëm në fushën e bioteknologjisë duke ofruar Shërbim të Avancuar të Prodhimit të Nanobody-ve. Këto analiza janë shumë të specializuara dhe të dizajnuara për t'iu përshtatur nevojave të profesionistëve të kërkimit dhe shkencëtarëve që punojnë në farmaceutikë dhe biomjekësi.

Pyetje të shpeshta

  • 1. Kafshët e racës Camelidae (alpakat, devetë) kanë titre të ulëta të antitrupave pas imunizimit me antigjene me peshë të ulët molekulare ose antigjene të konservuara.

  • 2. Përqindja e kloneve specifike në gjenin e amplifikuar VHH ishte e ulët.

  • 3. Amplifikimi PCR nuk tregoi produkt ose banda VHH jo-specifike.

  • 4. Produktet e shprehjes ekzistojnë në formën e trupave të përfshirjes së patretshme.

  • 5. Afiniteti i nano-trupit të shprehur dhe të pastruar me antigjenin u ul.

  • 6. Në ELISA ose zbulimin e rrjedhës, sinjali i sfondit është i lartë.

referencë

[1] Jin BK, Odongo S, Radwanska M, Magez S. NANOBODIES®: Një përmbledhje e zbatimeve diagnostikuese dhe terapeutike. Int J Mol Sci. 2023;24(6):5994. Botuar më 22 Mars 2023. doi:10.3390/ijms24065994
[2] Mashayekhi V, Schooten E, van Bergen En Henegouwen PMP, Kijanka MM, Oliveira S. Terapia fotodinamike e synuar nga Nanobody: Prodhimi dhe pastrimi i Nanobody. Metodat Mol Biol. 2022; 2451: 481-493. doi: 10.1007/978-1-0716-2099-1_21
[3] de Marco A. Shprehja rekombinante e nano-trupave dhe imunoreagjentëve të derivuar nga nano-trupat. Protein Expr Purif. 2020;172:105645. doi:10.1016/j.pep.2020.105645
[4] Muyldermans S. Nanotrupat: antitrupa natyralë me një domen të vetëm. Annu Rev Biochem. 2013;82:775-797. doi:10.1146/annurev-biochem-063011-092449
[5] Pleiner T, Bates M, Görlich D. Një kuti mjetesh me nanotrupa sekondarë IgG kundër miut dhe lepurit. J Cell Biol. 2018;217(3):1143-1154. doi:10.1083/jcb.201709115